ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube ဓာတုစက်မှုလုပ်ငန်းအတွက် ဓာတုအစိတ်အပိုင်း ၊Deficiency of SPECC1L သည် spliced ​​joints များ၏ တည်ငြိမ်မှုကို တိုးလာစေပြီး cranial neural crest cells များ လျော့နည်းကျဆင်းလာပါသည်။

Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 ဓာတုစက်မှုလုပ်ငန်းအတွက် Duplex Welded Tube

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.Stainless Steel ချောမွေ့သောပိုက်များ၊ တောက်ပြောင်သော annealed ပြွန်များ၊ ချောမွေ့မှုမရှိသော coiled tubing စသည်တို့တွင် အထူးပြုထားသည့် ဦးဆောင်ထုတ်လုပ်သူဖြစ်သည်။ဖောက်သည်များ အဆင်ပြေစေရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့တွင် ဂဟေပိုက်များနှင့် ပြွန်များ ရှိပါသည်။Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ခေတ်မီဆုံး ထုတ်လုပ်ရေးနှင့် စမ်းသပ်ကိရိယာများ ရှိသည်။သင့်လိုအပ်ချက်ကို ကျွန်ုပ်တို့ အပြည့်အဝ ဖြည့်ဆည်းပေးနိုင်ပါသည်။စံချိန်စံညွှန်းအရ အလွန်တင်းကြပ်စွာ၊ ကျွန်ုပ်တို့မှ ထုတ်လုပ်သော ပြွန်များသည် မှန်ကန်သော OD နှင့် WT သည်းခံနိုင်မှု အမြဲရှိသည်။သည်းခံမှုထိန်းချုပ်မှုသည် စံချိန်စံညွှန်းများနှင့်အညီ တင်းကြပ်စွာ ထုတ်လုပ်ထားသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ထုတ်ကုန်များသည် ဖောက်သည်များနှင့် အမြဲကျေနပ်နေပါသည်။ဖောက်သည်များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ ထုတ်ကုန်များကို ဝယ်ယူပြီး အမြတ်ငွေများ ပိုမိုဖန်တီးပေးပါသည်။
က) OD (အချင်း ) : 3.18mm မှ 101.6mm
b) WT (နံရံအထူ) : 0.5mm မှ 20mm
c) အရှည် : ဖောက်သည်၏လိုအပ်ချက်အရ
ဃ) စံနှုန်းများ : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 စသည်တို့
င) လုပ်ငန်းစဉ်နည်းလမ်း- ERW၊ EFW စသည်ဖြင့်

ဆလိုက်တစ်ခုလျှင် ဆောင်းပါးသုံးပုဒ်ကို ပြသသည့် ဆလိုက်ဒါများ။ဆလိုက်များတစ်လျှောက် ရွှေ့ရန် နောက်ဘက်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် ဆလိုက်တစ်ခုစီကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ထိန်းချုပ်မှုခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။
cranial neural crest cells (CNCC) သည် သန္ဓေသား၏ အာရုံကြောခေါက်များမှ ဖယ်ထုတ်ပြီး အလယ်မျက်နှာတည်ဆောက်ပုံအများစုကို ဖွဲ့စည်းသည့် pharyngeal arches သို့ ရွှေ့ပြောင်းသွားပါသည်။CNCC ကမောက်ကမဖြစ်မှုသည် ပုံမှန်မွေးရာပါပုံမမှန်သော orofacial cleft ၏ etiology တွင် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်ပါသည်။ပုံမှန်မဟုတ်သော ကွဲလွဲမှုများရှိသော လူနာများတွင် Heterozygous SPECC1L ဗီဇပြောင်းလဲမှုများကို တွေ့ရှိထားသည်။ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မွေးမြူထားသော SPECC1L သော့ချဆဲလ်များရှိ canonical adhesive junction (AJ) အစိတ်အပိုင်းများ၊ β-catenin နှင့် E-cadherin တို့၏ စွန်းထင်းမှုကို အစီရင်ခံပြီး အီလက်ထရွန်မိုက်ခရိုဂရပ်များသည် AJ ၏ apical-basal ပျံ့နှံ့မှုကို ပြသသည်။craniofacial morphogenesis တွင် SPECC1L ၏အခန်းကဏ္ဍကိုနားလည်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Specc1l ချို့တဲ့သောမောက်စ်မော်ဒယ်ကို ဖန်တီးခဲ့သည်။Homozygous mutants များသည် သန္ဓေသားသေစေသော အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းနှင့် CNCC lamination ချို့ယွင်းခြင်းတို့ကို ပြသသည်။AJ ပရိုတင်းကို စွန်းထင်းစေခြင်းသည် mutant neural folds တွင် တိုးလာသည်။ဤ AJ ချွတ်ယွင်းချက်သည် AJ ကို ဖျက်သိမ်းရန် လိုအပ်သော CNCC delamination ချို့ယွင်းချက်နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ထို့အပြင်၊ Specc11 mutant များသည် PI3K-AKT အချက်ပြမှုကို လျှော့ချပြီး apoptosis တိုးလာပါသည်။ဗီထရိုတွင်၊ တောရိုင်းဆဲလ်များတွင် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းကို အပျော့စား ဟန့်တားခြင်းသည် AJ အပြောင်းအလဲများကို ဖြစ်ပေါ်စေရန် လုံလောက်ပါသည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ SPECC1L နှောင့်နှေးစေသော AJ အပြောင်းအလဲများကို PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို အသက်သွင်းခြင်းဖြင့် ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်သည်။စုစည်းထားသော ဤအချက်အလက်များအရ SPECC1L သည် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းနှင့် AJ ဇီဝဗေဒ၏ ဆန်းသစ်သောထိန်းညှိမှုအဖြစ်၊ အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းနှင့် CNCC stratification အတွက် လိုအပ်သည်ဟု အကြံပြုအပ်ပါသည်။
Cranial neural crest cells (CNCCs) သည် dorsal neuroectoderm တွင် နေရာချထားပြီး epithelial-mesenchymal transition (EMT)1,2,3 ပါ၀င်သည့် လုပ်ငန်းစဉ်အားဖြင့် ဖွံ့ဖြိုးဆဲ အာရုံကြောခေါက်များ၏ neuroepithelium မှ ဖယ်ထုတ်သည်။ပျံ့နှံ့နေသော epithelial CNCCs များသည် intercellular လမ်းဆုံများကိုနှောက်ယှက်ပြီး ပထမနှင့်ဒုတိယ pharyngeal arches ကိုဖြည့်ပြီး craniofacial အရိုးနုအများစုကိုဖွဲ့စည်းသည့် mesenchymal CNCCs များဖြစ်လာသည်။ထို့ကြောင့်၊ CNCC လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းညှိပေးသည့် မျိုးဗီဇများသည် အမေရိကန်တစ်နိုင်ငံတည်းတွင် မွေးဖွားမှု 1/800 တွင် အဖြစ်များဆုံးဖြစ်သော orofacial clefts များကဲ့သို့သော မွေးရာပါ ကွဲလွဲမှုများ၏ ဖြစ်စဉ်တွင် မကြာခဏ အနှောင့်အယှက်ဖြစ်နေပါသည်။မွေးရာပါ ပုံမမှန်ခြင်း ၈။
CNCC ၏ delamination သည် 8.5 မှ 9.5 ရက်အတွင်း ကြွက်များတွင် သန္ဓေတည်သော သန္ဓေသားဖွံ့ဖြိုးမှု၏ ရှေ့နားရှိ အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းနှင့် တိုက်ဆိုင်ပါသည်။မောက်စ် orofacial ကွဲအက်ဆက်စပ်နေသော ဗီဇအများအပြား၏ ဗီဇပြောင်းများသည် Irf69၊10၊ Ghrl310၊ Cfl111 နှင့် Pdgfrα12 အပါအဝင် အာရုံကြောပြွန်ချို့ယွင်းမှုပုံစံအချို့ကို ပြသသည်။သို့သော် Splotch mutant mouse (Pax3) သည် CNCC stratification သို့မဟုတ် migration 13,14 တွင် မည်သည့်အကျိုးသက်ရောက်မှုမှမရှိဘဲ အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းနှင့် CNCC stratification ၏လုပ်ငန်းစဉ်များကို သီးခြားဟုယူဆနိုင်သည်။CNCC ခွဲခြမ်းစိပ်ဖြာခြင်းနှင့် အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းတွင် ချို့ယွင်းချက်များပါရှိသော ထပ်လောင်းမောက်စ်မော်ဒယ်များသည် ဤလုပ်ငန်းစဉ်နှစ်ခု၏ ဘုံမော်လီကျူးအခြေခံကို အသေးစိတ်ဖော်ပြရန် ကူညီပေးပါလိမ့်မည်။
neuroepithelial ဆဲလ်များမှ CNCC ကို သီးခြားခွဲထုတ်ခြင်းသည် အခြားသော၊ E-cadherin၊ β-catenin၊ α-E-catenin၊ နှင့် actin filaments 2 နှင့်ဆက်စပ်သော α-actinin ပါဝင်သော ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးမှုများဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည့် ကော်လမ်းဆုံများ (AJs) ကို ဖျက်သိမ်းရန် လိုအပ်သည်။ အာရုံကြောခေါက်များရှိ E-cadherin လွန်ကဲစွာဖော်ပြခြင်းလေ့လာမှုများက CNCC delamination တွင် လျော့ချခြင်း သို့မဟုတ် နှောင့်နှေးခြင်းကို ပြသခဲ့သည်။အပြန်အလှန်အားဖြင့် E-cadherin ကို နှိမ်နင်းခြင်းသည် အစောပိုင်း stratification 15,16 တွင် ရလဒ်ထွက်ပေါ်သည်။CNCC stratification ကာလအတွင်း EMT ကို ဖျန်ဖြေပေးသည့် အချက်အများစုမှာ ကူးယူဖော်ပြခြင်းဆိုင်ရာအချက်များ (AP2α၊ Id2၊ FOXD3၊ SNAIL၊ TWIST၊ SOX10) နှင့် extracellular matrix (ECM) ကဲ့သို့သော matrix metalloproteinases (MMPs) ကဲ့သို့သော ပရိုတိန်းများကို ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်း CNCCs များသည် တိုက်ရိုက် cytoskeletal ဖြစ်သည် မသိရသေးပါဘူး။PI3K-AKT လမ်းကြောင်းသည် အဓိကအားဖြင့် ကင်ဆာသုတေသန 17 မှ E-cadherin အဆင့်ကို ဆန့်ကျင်ကြောင်း လူသိများသည်။မကြာသေးမီက လေ့လာချက်များအရ ကြွက်များတွင် PDGFα-based PI3K-AKT အချက်ပြမှု ဆုံးရှုံးခြင်းသည် အာခေါင်ကွဲနှင့် အာရုံကြောပြွန်ချို့ယွင်းချက်များ အပါအဝင် မျက်နှာနှာခေါင်းဆိုင်ရာ မူမမှန်မှုများကို ဖြစ်စေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ CNCC stratification အပေါ် PI3K-AKT လမ်းကြောင်းနှင့် AJ တည်ငြိမ်မှုကြား ဆက်နွယ်မှု မရှင်းလင်းပါ။
SPECC1L ကို ပါးစပ်မှ မျက်လုံးအထိ ကျယ်ပြန့်သော ပြင်းထန်သော အကွဲအပြဲ ရှိသော လူနှစ်ဦးတွင် ပထမဆုံး မျိုးပြောင်း ဗီဇအဖြစ် ကျွန်ုပ်တို့ ယခင်က သတ်မှတ်ခဲ့ပြီး၊ Oblique cleft (ObFC) သို့မဟုတ် Tessier IV18 cleft ဟုခေါ်သည်။SPECC1L ဗီဇပြောင်းလဲမှုများကို autosomal dominant Opitz G/BBB Syndrome (OMIM #145410) ဖြင့် မျိုးဆက်ပေါင်းစုံ မိသားစုနှစ်ခုတွင် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ယင်းတွင် ထိခိုက်သူတစ်ဦးချင်းစီတွင် နှုတ်ခမ်းကွဲ/နှုတ်ခမ်းကွဲနှင့် Tibi Overdistance Syndrome (OMIM #145420)20 .Opitz G/BBB ရောဂါဖြစ်ပွားမှု၏ထက်ဝက်ကျော်သည် X-linked (OMIM #300000) ဖြစ်ပြီး၊ microtubule-ဆက်စပ်ဆဲလ်အရိုးစု၏ပရိုတင်း 22 ကို encode လုပ်သော MID1 ဗီဇတွင် ဗီဇပြောင်းလဲမှုများကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းဖြစ်သည်။microtubules နှင့် actin cytoskeleton တို့နှင့်ဆက်စပ်နေသော ပရိုတင်းတစ်ခုလည်းဖြစ်သော SPECC1L သည် ဆဲလ်များ တွယ်ကပ်မှုနှင့် ရွှေ့ပြောင်းမှု 18 ကာလအတွင်း actin cytoskeleton ပြန်လည်မွမ်းမံခြင်းအတွက် လိုအပ်သော အချက်ပြမှုကို ပြေလည်စေနိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။vitro နှင့် vivo လေ့လာမှုများမှတစ်ဆင့် SPECC1L သည် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းမှတစ်ဆင့် AJ တည်ငြိမ်မှုကို ဆန်းသစ်သော ထိန်းညှိမှုတစ်ခုအဖြစ် ဖော်ပြထားပါသည်။ဆယ်လူလာအဆင့်တွင်၊ SPECC1L ချို့တဲ့မှုသည် pan-AKT ပရိုတင်းအဆင့်ကို ကျဆင်းစေပြီး AKT လမ်းကြောင်းကို ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ဖယ်ရှားလိုက်သော AJ ၏ apical-basal ကွဲလွဲမှု တိုးလာပါသည်။vivo တွင်၊ Specc11 ချို့တဲ့သောသန္ဓေသားသည် ချို့ယွင်းသောအာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းကိုပြသပြီး CNCC ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လျှော့ချပေးသည်။ထို့ကြောင့်၊ SPECC1L သည် ပုံမှန် CNCC လုပ်ဆောင်ချက်အတွက် လိုအပ်သော ထိန်းညှိထားသော ဆဲလ်များ ကပ်တွယ်မှု-အခြေခံအချက်ပြမှုတွင် လုပ်ဆောင်သည်။
ဆဲလ်လူလာအဆင့်တွင် SPECC1L ၏ အခန်းကဏ္ဍကို လက္ခဏာရပ်ပြရန်၊ SPECC1L18 တွင် ယခင်ကဖော်ပြထားသော တည်ငြိမ်သော osteosarcoma ဆဲလ်လိုင်း U2OS ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။SPECC1L (kd) knockdown ပါရှိသော တည်ငြိမ်သော U2OS ဆဲလ်များသည် SPECC1L စာသားမှတ်တမ်းများနှင့် ပရိုတိန်းအဆင့်များတွင် အလယ်အလတ် (60–70%) လျော့ကျသွားပြီး actin cytoskeleton ၏ ရွှေ့ပြောင်းခြင်းနှင့် ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းခြင်းတွင် ချို့ယွင်းချက်များနှင့်အတူ 18. ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ ပြင်းထန်စွာ လျော့ကျသွားပါသည်။ SPECC1L သည် mitotic ချို့ယွင်းချက်များကို ဦးတည်စေသည် ၂၃။နောက်ထပ် လက္ခဏာရပ်များ အရ၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ တည်ငြိမ်သော SPECC1L-kd ဆဲလ်များသည် မြစ်ဆုံ၏ အလွန်မြင့်မားသော ဒီဂရီတွင် morphology ကို ပြောင်းလဲခဲ့သည် (ပုံ 1) ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။လူတစ်ဦးချင်း ထိန်းချုပ်သည့်ဆဲလ်များနှင့် kd ဆဲလ်များသည် အနိမ့်ဆုံးမြစ်ဆုံတွင် ဆင်တူသည် (ပုံ 1A၊D)။ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် 24 နာရီအကြာတွင် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များသည် ၎င်းတို့၏ cuboidal ပုံသဏ္ဍာန် (ပုံ. 1B၊ E) ကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားရှိပြီး SPECC1L-kd ဆဲလ်များသည် ရှည်သွားသည် (ပုံ။ 1C၊ F)။ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှု၏အတိုင်းအတာကို vivo တိုက်ရိုက်ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းဖြင့် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များနှင့် kd ဆဲလ်များ (ရုပ်ရှင် 1)။ဆက်စပ်ဆဲလ်များတွင် SPECC1L ၏အခန်းကဏ္ဍကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ၎င်း၏အသုံးအနှုန်းကို ဦးစွာစစ်ဆေးခဲ့သည်။SPECC1L ပရိုတိန်းအဆင့်များသည် ပေါင်းစပ်မှု (ပုံ 1G) တွင် တိုးလာသော်လည်း SPECC1L စာသားမှတ်တမ်းအဆင့်များ မတိုးလာသည် (ပုံ 1H)။ထို့အပြင်၊ ဆဲလ်သိပ်သည်းဆ တိုးလာသည်နှင့်အမျှ၊ အမြှေးပါးနှင့်ဆက်စပ်သော β-catenin (ပုံ. 2A'-E') နှင့် ထပ်နေသောပုံစံတစ်ခုဖြင့် intercellular boundaries (ပုံ. 2A-E) တွင် SPECC1L ပရိုတင်းများ စုပုံလာသည်။SPECC1L ၏ actin cytoskeleton 18,23 နှင့် SPECC1L တို့သည် actin-based adhesive junctions (AJ) နှင့် ဓါတ်ပြုနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ဆဲလ်များသည် U2OS ဆဲလ်များ (AC) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မြင့်မားသော ဆုံစည်းမှု (F) တွင် ရှည်လျားသည်။ဤနေရာတွင် ပြထားသည်မှာ မတူညီသောဆဲလ်သိပ်သည်းဆအတွက် ကျွန်ုပ်တို့ရွေးချယ်ထားသော အချိန်အမှတ်ခြောက်ခု (T1၊ T3၊ T6) တို့ဖြစ်သည်။(ဆ) SPECC1L ပရိုတိန်းသည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များတွင် ပေါင်းဆုံမှုအဆင့်နိမ့်သည်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မြင့်မားသောမြစ်ဆုံတွင် တည်ငြိမ်ကြောင်းပြသသည့် အနောက်အုပ်စုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။SPECC1L ၏ အနောက်တိုင်း အပိုင်းသည် မျှော်မှန်းထားသော 120 kDa တီးဝိုင်းနှင့် ပိုမြင့်သော မော်လီကျူးအလေးချိန်တီးဝိုင်းကို ပြသသည်၊ ဖြစ်နိုင်သည်၊ ဖြစ်နိုင်သည်မှာ ဘာသာပြန်ပြီးနောက် (*)။အနိမ့်ပိုင်းနှင့် မြင့်မားသော မြစ်ဆုံအတွက် တူညီသော အခြေအနေများအောက်တွင် အနောက်တိုင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။SPECC1L ၏ အနိမ့်နှင့် မြင့်မားသော ဆုံရပ်တွင် ပြသထားသော ပုံများကို တူညီသော blot မှ ယူပါသည်။အလားတူ blot ကိုဖယ်ရှားပြီး β-actin antibody ဖြင့် ပြန်လည်စစ်ဆေးခဲ့သည်။(H) Quantitative RT-PCR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချက်သည် SPECC1L စာသားမှတ်တမ်းအဆင့်များတွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုများ မတွေ့ရှိရပါ။အမှားအယွင်းဘားများသည် လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှုလေးခုမှ SEM များကို ကိုယ်စားပြုသည်။
(AE) ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် U2OS ဆဲလ်များရှိ AJ အပြောင်းအလဲများကို SPECC1L နှောင့်နှေး (kd) ဖြင့် ဆဲလ်သိပ်သည်းဆများစွာကို ကိုယ်စားပြုသည့် အချိန်အမှတ် (T1-T6) ခြောက်ခုကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ဤအချိန်အချက်များအနက် ပထမငါးခုတွင် ဆဲလ်တစ်ခုတည်း (T1)၊ သေးငယ်သောဆဲလ်အစုအဝေး (T2) ၏ 50-70% ပေါင်းစပ်မှု၊ kd ဆဲလ်များကို ပြန်လည်ပုံဖော်ခြင်းမပြုဘဲ ပေါင်းစပ်မှု (T3)၊ kd ဆဲလ်များကို ပြန်လည်ပုံဖော်ခြင်း (T4) နှင့် 24 နာရီပြောင်းလဲမှုများ ပါဝင်သည်။kd (T5) ဆဲလ်များ၏နောက်ပုံစံ။SPECC1L ပရိုတိန်းသည် T1 (A) တွင် cytoplasm တွင် အများစု ပြန့်ကျဲနေသော်လည်း ၎င်း၏ အစုအဝေးကို နောက်ဆက်တွဲ အမှတ်များ (B-E၊ မြှားများ) တွင် တွေ့ရှိရသည်။(FJ) β-catenin သည် AJ complex နှင့်ဆက်စပ်နေသော intercellular boundaries များတွင် အလားတူစုပုံခြင်းကိုပြသသည်။(A'-E') SPECC1L နှင့် β-catenin တို့သည် မြင့်မားသောဆဲလ်သိပ်သည်းဆ (မြှားများ) ဖြင့် ဆဲလ်ဘောင်များအတွင်း ထပ်နေသော စွန်းထင်းမှုကို ပြသသည်။(F'-J') SPECC1L-kd ဆဲလ်များတွင် β-catenin စွန်းထင်းမှုသည် ဆဲလ်သိပ်သည်းဆနည်းသော (F'-H') တွင် ပုံမှန်ပေါ်လာသော်လည်း ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများ (I', J'; မြှားများ) AJ ကို ညွှန်ပြသည် ပြောင်းလဲသွားပြီ။ဘားများ = 10 µm ။
ထို့နောက် AJ တွင် SPECC1L ချို့တဲ့မှု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့ ကြိုးစားခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် F-actin၊ myosin IIb၊ β-catenin နှင့် E-cadherin24,25,26,27 အပါအဝင် canonical အစိတ်အပိုင်းများအပါအဝင် AJ-ဆက်စပ်အမှတ်အသားများအများအပြားကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း SPECC1L-kd ဆဲလ်များတွင် Actin stress အမျှင်များ တိုးလာသည် (ပုံ။ 3A၊B) 18 .actin filaments များနှင့်ဆက်စပ်နေသော Myosin IIb သည် vitro အတွင်းရှိ SPECC1L-kd ဆဲလ်များတွင် အလားတူတိုးလာသည်ကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ။ 3C၊D)။AJ-ဆက်စပ်နေသည့် ဘီတာ-ကေတီနင်သည် ဆဲလ်အမြှေးပါးတွင် ကက်ဒရီရင်းနှင့် ချိတ်တွဲကာ ထိန်းချုပ်ကုဗိုဆိုက်များရှိ ပုံမှန် "ပုဆိုး" ထုတ်ဖော်မှုပုံစံကို ပြသသည် (ပုံ 3E,G)။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ confocal microscopy ကိုအသုံးပြုထားသော ပြားချပ်ချပ်ရုပ်ပုံများတွင် β-catenin (ပုံ. 3E,F) နှင့် E-cadherin (ပုံ. 3G,H) တို့သည် ရောထွေးနေသော SPECC1L-ချို့တဲ့သောဆဲလ်များ၏ဆဲလ်အမြှေးပါးပေါ်တွင် စွန်းထင်းနေသော ရှည်လျားသောအရောင်အဆင်းပုံစံများကို ပြသထားသည်။kd ဆဲလ်များတွင် AJ-ဆက်စပ်နေသော ဘီတာ-ကေတီနင် စွန်းထင်းမှု ချဲ့ထွင်ခြင်း၏ ဤချဲ့ထွင်မှုသည် အထင်ရှားဆုံးဖြစ်သည်၊ သို့သော် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်၏ အပြောင်းအလဲများ (ပုံ. 2F-J, F'-J') ၏ ရှေ့တွင် ပေါ်လာသည်။ဤတိုးချဲ့ AJ စွန်းထင်းခြင်း၏ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ သဘောသဘာဝကို ဆုံးဖြတ်ရန်၊ ထုတ်လွှင့်မှု အီလက်ထရွန် အဏုစကုပ် (TEM) (ပုံ 3I,J) ဖြင့် SPECC1L-kd U2OS ဆဲလ်များ၏ apical-basal မျက်နှာပြင်ပေါ်ရှိ ဆဲလ်ဘောင်များကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။AJ (မြှားများ) ညွှန်ပြသော သီးခြားအီလက်ထရွန်သိပ်သည်းသောဒေသများပါရှိသော ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ (ပုံ 3I) နှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့် kd ဆဲလ်များ (ပုံ. 3J) သည် မြင့်မားသောအီလက်ထရွန်သိပ်သည်းဆညွှန်ပြသော AJ ၏ ကြီးမားပြီး ဆက်စပ်နေသောနေရာများကို apicobasal လေယာဉ်တစ်လျှောက်တွင် ပြသထားသည်။.ထို့အပြင်၊ အလျားလိုက်အပိုင်းများတွင်၊ ဘီ-ကတီနင်နှင့် E-cadherin စွန်းထင်းသောကြိုးများ (ပုံ. 3F,H) ၏တိုးချဲ့ပုံစံကိုရှင်းပြသည့် kd ဆဲလ်များ (ပုံ. S1A,B) တွင် ကျယ်ပြန့်သောဆဲလ်အမြှေးပါးခေါက်များကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။AJs တွင် SPECC1L ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ပံ့ပိုးပေးသောအားဖြင့်၊ β-catenin သည် ဆက်စပ် U2OS ဆဲလ်များ၏ lysates တွင် SPECC1L နှင့် တွဲဖက်၍ ခုခံအားကျစေသည်။AJ အမှတ်အသားများအတွက် တိုးချဲ့ခုခံကာကွယ်ခြင်းနှင့်အတူ၊ TEM ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် SPECC1L ချို့တဲ့မှုသည် AJ apical-basal သိပ်သည်းဆနှင့် ကွဲပြားမှုကို တိုးမြင့်စေသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့၏ယူဆချက်နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။
(AH) ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် ၄၈ နာရီအတွင်း kd ဆဲလ်များတွင် F-actin စွန်းထင်းမှု တိုးလာသည် (T6; A, B)။F-actin (C, D) နှင့်ဆက်စပ်နေသော myosin IIb ၏ ပြောင်းလဲခြင်း စွန်းထင်းခြင်း။ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ (E, G) တွင် ဘီ-ကတီနင်နှင့် အီး-ကက်ဒရင် အမြှေးပါးစွန်းထင်းမှုပုံစံကို SPECC1L-kd (F, H) ဆဲလ်များတွင် မြှင့်တင်ထားသည်။ဘားများ = 10 µm ။(I–J) apical-basal intercellular junction ကို စောင့်ကြည့်သော အီလက်ထရွန် အမိုက်ခရိုပုံများ။ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များသည် စေးကပ်နေသော လမ်းဆုံများ (I၊ မြှားများ) ကို ညွှန်ပြသည့် ကွဲပြားသော အီလက်ထရွန်သိပ်သည်းသော ဒေသများကို ပြသသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ SPECC1L-kd ဆဲလ်ရှိ apical-basal လမ်းဆုံတစ်ခုလုံးသည် အီလက်ထရွန်သိပ်သည်းစွာ (J၊ မြှားများ) ပေါ်လာပြီး ကော်လမ်းဆုံများ ပြန့်ကျဲလာမှုနှင့် သိပ်သည်းဆတိုးလာမှုကို ညွှန်ပြသည်။(K) β-catenin သည် ပေါင်းစပ် U2OS ဆဲလ် lysates တွင် SPECC1L နှင့် ပူးတွဲ ခုခံအား ကျဆင်းစေသည်။အမှီအခိုကင်းသော စမ်းသပ်မှုလေးခုအနက်မှ တစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသည့် နေရာတစ်ခုမှ ရိုက်ကူးထားသော ပုံ။
craniofacial morphogenesis တွင် SPECC1L ၏ အခန်းကဏ္ဍကို နားလည်ရန်၊ intron 1 နှင့် Specc1l မှတ်တမ်းများကို ကိုယ်စားပြုသည့် သီးခြားလွတ်လပ်သော ES ထောင်ချောက်ဆဲလ်လိုင်းနှစ်ခုဖြစ်သည့် DTM096 နှင့် RRH048 (BayGenomics, CA) ကို အသုံးပြု၍ Specc1l ချို့တဲ့သောမောက်စ်မော်ဒယ်ကို ဖန်တီးခဲ့သည် (ပုံ။ 1) .4A၊ ပုံ S2)။decoy vector ထည့်သွင်းမှု၏ genomic တည်နေရာကို ဂျီနိုမ်ပေါင်းစပ်မှုတစ်ခုလုံးဖြင့် ဆုံးဖြတ်ပြီး PCR (ပုံ။ S2) မှ အတည်ပြုသည်။ဗီဇထောင်ချောက် ဒီဇိုင်းနှစ်ခုလုံးသည် Specc11-lacZ သတင်းထောက်များကို ဖမ်းယူသည့်အခါတွင် ဘောင်အတွင်း ပေါင်းစပ်မှုကိုလည်း ခွင့်ပြုထားသည်။ထို့ကြောင့်၊ X-gal စွန်းထင်းမှုမှသတ်မှတ်ထားသော lacZ expression ကို Specc11 expression ၏ညွှန်ပြချက်တစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။အယ်လီလီနှစ်ခုလုံးသည် အလားတူ lacZ ထုတ်ဖော်မှုပုံစံများကို ပြသခဲ့ပြီး၊ intron 1 တွင် DTM096 ဗီဇထောင်ချောက်သည် RRH048 ထက် ပိုမိုအားကောင်းသည့် ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုကို ပြသခဲ့သည် (မပြပါ)။သို့သော် Specc1l သည် E8.5 (ပုံ 4B) တွင် အာရုံကြောခေါက်များအတွင်း အထူးပြင်းထန်သော ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုဖြင့် E9.5 နှင့် E10.5 (ပုံ 4C,D) ရှိ အာရုံကြောပြွန်နှင့် မျက်နှာလုပ်ငန်းစဉ်များတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ဖော်ပြခြင်းဖြစ်ပြီး၊ E10 မှာ5 နှင့် မျက်လုံးများ (ပုံ 4D)။E10.5 ရှိ ပထမဆုံး pharyngeal arch တွင် SPECC1L ဖော်ပြချက်သည် CNCC မျိုးရိုးနှင့်အညီ epithelium နှင့် အောက်ခံ mesenchyme18 တွင် ရှိနေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ယခင်က အစီရင်ခံတင်ပြခဲ့ပါသည်။CNCC တွင် SPECC1L စကားရပ်ကို စမ်းသပ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် E8.5 အာရုံကြောခေါက်များ (ပုံ 4E-J) နှင့် E9.5 ဦးခေါင်းခွံအပိုင်းများ (ပုံ 4K-) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။E8.5 တွင်၊ SPECC1L သည် NCC အမှတ်အသားများဖြင့် စွန်းထင်းနေသော ဆဲလ်များအပါအဝင် အာရုံကြောခေါက်များကို ပြင်းထန်စွာ စွန်းထင်းခဲ့သည် (ပုံ။ 4E၊ H)။E9.5 တွင်၊ SPECC1L (ပုံ။ 4K၊ N) သည် AP2A (ပုံ 4L၊ M) သို့မဟုတ် SOX10 (ပုံ. 4O, P) နှင့် တွဲဖက်ထားသော CNCC ရွှေ့ပြောင်းခြင်းကို ပြင်းထန်စွာ စွန်းထင်းစေပါသည်။
(က) ES DTM096 (intron 1) နှင့် RRH048 (intron 15) ဆဲလ် clones များတွင် လှည့်ဖြားသော အားနည်းချက်ကို ထည့်သွင်းပြသသည့် မောက်စ် Specc11 ဗီဇ၏ သရုပ်ဖော်ပုံ။(BD) E8.5 မှ E10.5 မှ Specc1l ကိုကိုယ်စားပြုသော သန္ဓေသားလောင်း၏ lacZ စွန်းထင်းခြင်း။NE = neuroectoderm၊ NF = အာရုံကြောခေါက်၊ PA1 = ပထမဆုံး pharyngeal arch။(EP) E8.5 (NF; EJ) အာရုံကြောခေါက်များနှင့် E9.5 (KP) ဦးခေါင်းခွံအပိုင်းများတွင် NCC အမှတ်အသားများဖြင့် AP2A နှင့် SOX10 တို့ကို SPECC1L ခုခံကာကွယ်ခြင်း။SPECC1L စွန်းထင်းမှုကို AP2A (F, G; မြှားခေါင်းများ) နှင့် SOX10 (I, J; မြှားခေါင်းများ) ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသော ဆဲလ်များအပါအဝင် အာရုံကြောခေါက်များ E8.5 (E, H; မြှားခေါင်းများ) တွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။E9.5 တွင်၊ SPECC1L သည် AP2A (L၊ M; မြှားများ) နှင့် SOX10 (O, P; မြှားများ) တံဆိပ်တပ်ထားသော ရွှေ့ပြောင်းခြင်း CNCCs (K, N; မြှားများ) တွင် ပြင်းထန်စွာ စွန်းထင်းနေပါသည်။
heterozygous Specc1lDTM096/+ နှင့် Specc1lRRH048/+ ကြွက်များကြားဖြတ်ကျော်ခြင်းသည် မျိုးဗီဇထောင်ချောက် alleles နှစ်ခုသည် ဖြည့်စွက်မဟုတ်ကြောင်းပြသပြီး ၎င်းဒြပ်ပေါင်း heterozygotes နှင့် သန္ဓေသား homozygotes နှစ်ခုစလုံးအတွက် gene trap allele သည် သန္ဓေတည်သေစေနိုင်သည် (ဇယား S1)။Mendelian အချိုးများသည် မွေးစတွင် heterozygotes ၏ရှင်သန်မှုနှုန်း ကျဆင်းသွားသည် (မျှော်လင့်ထားသော 1.34 နှင့် 2.0)။heterozygotes များကြားတွင် မွေးရာပါသေဆုံးမှု နည်းပါးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ သတိပြုမိကြပြီး အချို့မှာ craniofacial ကွဲလွဲချက်များ (ပုံ။ S3) ရှိသည်။သို့သော်၊ ဤ perinatal craniofacial phenotypes များ၏ ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်မှု နည်းပါးခြင်းသည် ၎င်းတို့၏ အရင်းခံ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ယန္တရားများကို လေ့လာရန် ခက်ခဲစေသည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် homozygous Specc11 mutants ၏ သန္ဓေသားသေစေသော ဖီနိုအမျိုးအစားကို အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။
E9.5–10.5 (ပုံ. 5A–D) ပြီးနောက် ဒြပ်ပေါင်းအများစုသည် မျိုးရိုးလိုက်သော သို့မဟုတ် တူညီသော Specc1lDTM096/RRH048 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားမဖွံ့ဖြိုးသေးပါ (ပုံ. 5A–D) နှင့် အာရုံကြောပြွန်သည် အရှေ့ဘက်တွင် မပိတ်ခဲ့ပါ (ပုံ။ 5B, D) နှင့် တစ်ခါတစ်ရံတွင် အနောက်မှပိတ်သွားသည် (မပြပါ) ..ဤဦးနှောက်အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်း ချို့ယွင်းချက်သည် E10.5 ရှိ အာရုံကြောခေါက်များတွင် ကျန်ရှိနေသော CNCC အမှတ်အသားပြု DLX2 အများစုနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး ခွဲခြမ်းစိပ်ဖြာခြင်းမရှိကြောင်း (ပုံ 5A'-D')။CNCC ၏ အလုံးစုံအရွယ်အစားကိုလည်း လျှော့ချခြင်းရှိ၊ မရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏ မျိုးရိုးဗီဇထောင်ချောက်လိုင်းများတွင် Wnt1-Cre နှင့် ROSAmTmG ဖြင့် CNCC လိုင်းများကို GFP ဖြင့် တဂ်လုပ်ထားသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် GFP+ NCC နှင့် NCC မဟုတ်သော GFP+ (RFP+) တို့ကို သန္ဓေသားတစ်ခုလုံးမှ စီစစ်ထားပါသည်။E9.5 တွင်၊ Flow-sorted GFP-တံဆိပ်တပ်ထားသော CNCC များ၏အချိုးအစားသည် WT နှင့် mutant သန္ဓေသားကြားတွင် သိသိသာသာပြောင်းလဲခြင်းမရှိပါ (မပြပါ)၊ ပုံမှန် CNCC သတ်မှတ်ချက်ကို ညွှန်ပြပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ SPECC1L-kd ဆဲလ်များတွင်တွေ့မြင်ရသည့်အတိုင်း AJ ဆဲလ်များ၏သိပ်သည်းဆ သို့မဟုတ် ပြန့်ကျဲမှုကြောင့်ဖြစ်နိုင်သည် (ပုံ 5B') (ပုံ 5B') တွင်ကျန်နေသော Wnt1-Cre နှင့် DLX2 စွန်းထင်းခြင်း (ပုံ 5B') သည် ချို့ယွင်းနေသော CNCC အလွှာကြောင့်ဖြစ်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယူဆပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် အာရုံကြောခေါက် (ပုံ 5E-R) တွင် CNCC ပါဝင်မှုကို အတည်ပြုရန် NCC အမှတ်အသားများကို SOX10၊ AP2A နှင့် DLX2 ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။E8.5 တွင် WT (ပုံ 5E၊ G၊ I) နှင့် Specc1l mutant (ပုံ. 5F၊ H, J) ၏ အပိုင်းများတွင် NCC အမှတ်အသားသုံးခုစလုံးအတွက် အာရုံကြောခေါက်ခြင်းကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။E9.5 တွင် NCC အမှတ်အသားများသည် WT ကဏ္ဍများ (ပုံ. 5M၊ O, Q) တွင် NCC ရွှေ့ပြောင်းခြင်းတွင် စွန်းထင်းနေချိန်တွင်၊ ကျန်ရှိသော NCC စွန်းထင်းမှုကို Specc1l မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားလောင်း (ပုံ. 5N၊ P, R) တွင် တွေ့ရပါသည်။SOX10 နှင့် DLX2 တို့သည် CNCCs များကို ရွှေ့ပြောင်းခြင်းအမှတ်အသားဖြစ်သောကြောင့်၊ ဤရလဒ်သည် SPECC1L-ချို့တဲ့သော CNCCs များသည် ရွှေ့ပြောင်းမှုလွန်ခြင်းဆိုင်ရာ သတ်မှတ်ချက်များကို ရရှိသော်လည်း အာရုံကြောခေါက်များမှ ရွှေ့ပြောင်းရန်ပျက်ကွက်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
Specc11 ချို့တဲ့ခြင်းကြောင့် အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်း၊ cranial neural crest cells နှင့် AJs များ ပျက်စီးခြင်းသို့ ဦးတည်သည်။
(A, B') Wnt1-Cre (A') ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသော ဦးနှောက်အာရုံကြောအမောက်ဆဲလ်များ (CNCC) ကို သယ်ဆောင်လာသော E9.5 WT (A) သန္ဓေသားလောင်း။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ Specc11 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားသည် ရွှေ့ပြောင်းမထားသော အာရုံကြောခေါက်များ (B)၊ မြှားခေါင်းများ) နှင့် CNCCs (B'၊ မြှားခေါင်းများ) ကို ပြသသည်။(C၊ D') E10.5 WT သန္ဓေသား E10.5 WT ၏ CNCC အမှတ်အသား DLX2 ၏ တောက်ပသော အကွက်ပုံများ (C၊ D') နှင့် Specc1l (D, D')။WT E10.5 သန္ဓေသားတွင်၊ DLX2-positive CNCC သည် ပါးစပ်ခုံးများ (C'၊ မြှားများ) ကို နယ်မြေချဲ့ထွင်စေပြီး မျိုးပြောင်းတွင် ထင်ရှားပေါ်လွင်သော စွန်းထင်းနေသော အာရုံကြောများ (D'၊ မြှားများ) နှင့် ပထမ pharyngeal arches (D'၊ မြှားများ)။CNCC ၏ ညံ့ဖျင်းမှုနှင့် ရွှေ့ပြောင်းခြင်းကို ညွှန်ပြသော စွန်းထင်းမှုအချို့ (မြှားများ) ဖြင့်။ER) အဆင့် E8.5 (E–L) နှင့် E9.5 (M–R) ရှိ WT နှင့် Specc1l မျိုးပြောင်းသန္ဓေသား၏ အပိုင်းများကို NCC အမှတ်အသားများဖြင့် SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H၊ O, P) နှင့် DLX2 (I, J, Q, R)။E8.5 တွင်၊ NCC စွန်းထင်းမှုကို ရိုင်း-အမျိုးအစား အာရုံကြောခေါက် (NF) နှင့် mutant အပိုင်းများတွင် တွေ့ရပါသည်။E8.5 WT (K) နှင့် mutant (L) တွင် SOX10 နှင့် β-catenin တို့ကို ရောနှောကာ စွန်းထင်းခြင်းသည် အာရုံကြောခေါက်များရှိ ဆဲလ်နယ်နိမိတ်များတွင် ဘီတာကေတီနင် စွန်းထင်းမှု တိုးလာသည်ကို ထင်ရှားစေသည်။E9.5 တွင်၊ ရွှေ့ပြောင်းခြင်း CNCCs (M, O, Q) ၏ရိုင်း-အမျိုးအစား စွန်းထင်းမှုကို တွေ့ရှိရပြီး မျိုးပြောင်းများတွင်၊ အကွဲအပြဲမရှိသော CNCC များသည် ပွင့်နေသော အာရုံကြောခေါက်များ (N, P, R) တွင်စွန်းထင်းနေပါသည်။(S–Z) E9.5 ပြောင်းလဲမှုနှင့်အတူ WT နှင့် Specc11DTM096/RRH048 သန္ဓေသား၏ coronal အပိုင်းများတွင် vivo AJ တံဆိပ်တပ်ခြင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင်။ညာဘက်အပေါ်ထောင့်တွင် အနီးစပ်ဆုံးအပိုင်းပိုင်းပြကွက်တစ်ခုကို ပြထားသည်။မျိုးပြောင်းတစ်ရှူးများ၏ အပိုင်းများတွင် F-actin (S, T) နှင့် myosin IIb (U, V) ၏ စွန်းထင်းမှု တိုးလာသည်ကို တွေ့ရှိရသည်။ပုံ 3 တွင်ရှိသော ဗီထရို ရလဒ်များနှင့် ဆင်တူသော မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားများတွင် β-catenin (W, X) နှင့် E-cadherin (Y, Z) အတွက် ပိုမိုကောင်းမွန်သော အမြှေးပါးအရောင်ခြယ်ခြင်းကို လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။(AA-BB) apical-basal cell ၏ နယ်နိမိတ်ကို ကျော်လွန်ကြည့်ရှုသော တောရိုင်းအမျိုးအစား သန္ဓေသားလောင်း၏ အပိုင်းတစ်ခု၏ အီလက်ထရွန် အမိုက်ခရိုပုံသည် ကော်ပတ်လမ်းဆုံများ (AA၊ မြှားများ) ကို ညွှန်ပြသော ထူးခြားသော အီလက်ထရွန်သိပ်သည်းသော ဒေသကို ပြသသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ Specc11 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသား (BB၊ မြှားများ) ၏အပိုင်းများတွင်၊ apicobasal လမ်းဆုံတစ်ခုလုံးသည် အီလက်ထရွန်သိပ်သည်းပြီး ကော်လမ်းဆုံများ ပြန့်ကျဲသွားမှု တိုးမြင့်လာမှုကို ညွှန်ပြနေသည်။
ပြောင်းလဲထားသော AJ ကြောင့်ဖြစ်သည်ဟူသော ယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန်အတွက် Specc1l မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားလောင်း၏ ထိတွေ့နေသော အာရုံကြောခေါက်များတွင် AJ တံဆိပ်တပ်ခြင်းကို စစ်ဆေးခဲ့သည် (ပုံ။ 5S-Z)။actin stress fibers (ပုံ. 5S၊ T) နှင့် actin fibers များပေါ်ရှိ myosin IIB စွန်းထင်းမှုကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း တိုးမြင့်လာမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ ဆဲလ်အချင်းချင်းနယ်နိမိတ်များတွင် β-catenin (ပုံ 5W၊ X) နှင့် E-cadherin (ပုံ. 5Y,Z) ၏ စွန်းထင်းမှု တိုးလာသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။E8.5 သန္ဓေသား၏ အာရုံကြောခြံများတွင် NCC ၏ β-catenin စွန်းထင်းမှုကိုလည်း စစ်ဆေးခဲ့သည် (ပုံ။ 5K၊ L)။β-catenin စွန်းထင်းမှုသည် Specc1l အာရုံကြောခေါက်များ (ပုံ. 5L နှင့် K) တွင် ပိုမိုအားကောင်းနေပုံရပြီး AJ အပြောင်းအလဲများ စတင်နေပြီဟု အကြံပြုထားသည်။E9.5 သန္ဓေသား၏ ဦးခေါင်းခွံ အပိုင်းများ၏ အီလက်ထရွန် အမိုက်စား ဂရပ်ဖစ်များတွင်၊ WT (ပုံ 5AA၊ BB နှင့် S1E-H) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက Specc1l သန္ဓေသားအတွင်း ပြန့်ကျဲနေသော အီလက်ထရွန်သိပ်သည်းဆ စွန်းထင်းမှု တိုးလာသည်ကို ထပ်မံတွေ့ရှိရပါသည်။ပေါင်းစည်းလိုက်သောအခါ၊ ဤရလဒ်များသည် SPECC1L-kd U2OS ဆဲလ်များတွင် ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro ရလဒ်များကို ပံ့ပိုးပေးပြီး မှားယွင်းသော AJ စွန်းထင်းမှုသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ mutant သန္ဓေသားများတွင် CNCC stratification ကို ရှေ့သို့ရောက်သည်ဟု အကြံပြုပါသည်။
AKT လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် E-cadherin တည်ငြိမ်မှုကြားတွင် ဆန့်ကျင်ဘက်ဆက်ဆံရေးကို သိရှိထားသည့်အတွက်၊ 17,28 PI3K-AKT အချက်ပြခြင်း၏ ပါဝင်ပတ်သက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် E9.5-10.5 တွင်သေခြင်းမှလွတ်ကင်းသော ကျွန်ုပ်တို့၏မျိုးရိုးသန္ဓေသားအချို့တွင် အရေပြားအောက်ပိုင်းအရည်ကြည်ဖုများကိုတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ယင်းအစား E13.5 (ပုံ။ S3) ဝန်းကျင်တွင် အခြေချခဲ့သည်။Subepidermal vesicles များသည် PDGFRα12 ကိုအခြေခံ၍ လျှော့ချထားသော PI3K-AKT အချက်ပြခြင်း၏ အမှတ်အသားတစ်ခုဖြစ်သည်။Fantauzzo et al ။(2014) တွင် PdgfraPI3K/PI3K မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားသန္ဓေသားများတွင် PDGFRα-အခြေခံ PI3K လုပ်ဆောင်ချက်ကို နှောင့်ယှက်ခြင်းသည် အရေပြားအောက်အရေပြားများ၊ အာရုံကြောပြွန်ချို့ယွင်းချက်များနှင့် အာခေါင်ကွဲ phenotypes များကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်ဟု (2014) က ဖော်ပြခဲ့သည်။အမှန်မှာ၊ pan-AKT နှင့် တက်ကြွသော ဖော့စဖိုရီလိတ် Ser473-AKT အဆင့်များကို Specc1l မျိုးပြောင်းတစ်ရှူးများတွင် vivo တွင် E9.5 သန္ဓေသားဖမ်းဆီးခြင်း (ပုံ။ 6A-D) သို့ လျှော့ချခဲ့သည်။phosphorylated Ser473-AKT ၏အဆင့်များ ကျဆင်းခြင်းသည် vivo ရှိ pan-AKT အဆင့်များ (ပုံ။ 6E) နှင့် in vitro (ပုံ။ 6F) ကျဆင်းခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။U2OS ဆဲလ်များသည် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများနှင့် AJ သိပ်သည်းဆ (ပုံ 6D) တို့နှင့် ပြင်းထန်စွာ ကိုက်ညီမှုရှိမှသာ ဗီတိုအတွင်း လျော့ကျမှုကို တွေ့ရှိရပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များအရ SPECC1L သည် craniofacial morphogenesis တွင် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်း၏ ဆန်းသစ်သော အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုအပ်ပါသည်။
(A–E) E8.5 (A,B) နှင့် E9.5 (C,D) ဦးခေါင်းခွံအပိုင်းများ သို့မဟုတ် Specc1l မျိုးပြောင်းသန္ဓေသား (E) မှ E9.5 lysates (E) သည် တက်ကြွသော ဖော့စဖောရဆေး S473-AKT နှင့် pan-AKT ပရိုတိန်းလျှော့ချမှုအဆင့်များကိုပြသသည် ထိန်းချုပ်မှု WT နှင့်နှိုင်းယှဉ်။အနောက်တိုင်း သုတ်လိမ်းခြင်းကို တူညီသောအခြေအနေများအောက်တွင် တောရိုင်းအမျိုးအစား lysates နှင့် mutant lysates များတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။SPECC1L အတွက် ပြထားသည့် ပုံများကို တစ်ကွက်မှ ယူထားသည်။တူညီသော blot ကိုဖယ်ရှားပြီး anti-pan-ACT နှင့် β-actin ပဋိပစ္စည်းများဖြင့် ပြန်လည်စစ်ဆေးခဲ့သည်။E8.5 အာရုံကြောခေါက်များ (A၊ B) ရှိ Pan-AKT အဆင့်များနှင့် E9.5 ဦးခေါင်းခွံအပိုင်းများရှိ phosphorylated S473-AKT အဆင့်များကို သိသိသာသာ လျှော့ချခဲ့သည်။(စ) မြင့်မားသောမြစ်ဆုံတွင် ရိတ်သိမ်းထားသော SPECC1L-kd U2OS ဆဲလ်များ၏ lysates တွင်ပန်-AKT အဆင့်ကို အလားတူလျှော့ချခဲ့သည်။Error bars များသည် သီးခြားလွတ်လပ်သော အနောက်တိုင်း ပမာဏသုံးမျိုးမှ SEM များကို ကိုယ်စားပြုသည်။(GJ) E9.5 တွင် KI67 ဖြင့် စွန်းထင်းနေသော WT သန္ဓေသား၏ အပိုင်းများနှင့် Caspase 3 အသီးသီး ဆဲလ်များ ကြီးထွားမှု (G, G') နှင့် apoptotic လုပ်ဆောင်မှု အနည်းငယ် (H, H') ကို ပြသသည်။Specc11 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားလောင်းများသည် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သော ဆဲလ်ကြီးထွားမှု (I) ကိုပြသသော်လည်း apoptosis ဖြစ်ပွားနေသောဆဲလ်အရေအတွက် (J) သိသိသာသာတိုးလာသည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ကြီးထွားမှုနှင့် apoptosis အမှတ်အသားများကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။WT mutants များအတွက် 82.5% နှင့် KI67 စွန်းထင်းမှုဖြင့်တိုင်းတာသော Specc1l mutants များအတွက် 86.5% ပြန့်ပွားမှုအညွှန်းကိန်းဖြင့် E9.5 သန္ဓေသားပေါက်ပွားမှု (ပုံ 6E, G နှင့် I နှိုင်းယှဉ်) (ပုံ 6E, G နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသည်) (p <0.56၊ Fisher's အတိအကျစမ်းသပ်မှု။)အလားတူပင်၊ သန္ဓေသားမဖမ်းမချင်း E8.5 တွင် အာရုံကြောခေါက်များတွင် ခြစ်ထားသော caspase 3 ကို စွန်းထင်းခြင်းဖြင့် တိုင်းတာသော apoptosis တွင် မည်သည့်ကွာခြားချက်ကိုမျှ ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရှိခဲ့ပါ။ (မပြပါ)။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ E9.5 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားအားလုံးတွင် apoptosis သိသိသာသာတိုးလာသည် (ပုံ။ 6F၊ H နှင့် J)။ဤ apoptosis ၏အလုံးစုံတိုးလာမှုသည် PI3K-AKT အချက်ပြမှုလျှော့ချခြင်းနှင့် အစောပိုင်းသန္ဓေသားသေဆုံးမှု 29,30,31 တို့နှင့်ကိုက်ညီသည်။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ kd ဆဲလ်များရှိ AJ ပြောင်းလဲမှုများတွင် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းအတွက် အကြောင်းရင်းကို အတည်ပြုရန်၊ ထိန်းချုပ်မှုနှင့် kd ဆဲလ်လမ်းကြောင်းကို ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပြောင်းလဲခဲ့သည် (ပုံ 7A-F)။SPECC1L-kd ဆဲလ်များတွင် တွေ့ရသော ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှု ဖီနိုအမျိုးအစားကို အမှတ်အသားအဖြစ် အသုံးပြုကာ၊ အရှည်ဆုံးအတိုင်းအတာ (အလျား) နှင့် ဆက်စပ်ဒေါင်လိုက်အတိုင်းအတာ (အနံ) အချိုးကို အသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့ တွက်ချက်ခဲ့သည်။1 ၏အချိုးသည် အတော်လေးဝိုင်းသော သို့မဟုတ် ကုဗိုက်ဆဲလ်များ (ပုံ 7G) အတွက် မျှော်လင့်သည်။ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်အပြင်၊ β-catenin စွန်းထင်းခြင်း (ပုံ. 7A'-F') ဖြင့် AJ ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကိုလည်း အတည်ပြုပါသည်။wortmannin ကို အသုံးပြု၍ PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို တားမြစ်ခြင်းသည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ (ပုံ 7A၊ C) နှင့် AJ (ပုံ 7A') တွင် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ကို ပြောင်းလဲရန် လုံလောက်ပါသည်။PI3K-AKT activator SC-79 သည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များရှိ ဆဲလ်ပုံစံ (ပုံ။ 7A၊ E) သို့မဟုတ် AJ ချဲ့ထွင်မှု (ပုံ။ 7A') ကို မထိခိုက်စေပါ။SPECC1L-kd ဆဲလ်များတွင်၊ PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို ထပ်မံဖိနှိပ်ခြင်းကြောင့် apoptosis (ပုံ. 7B,D) နှင့် β-catenin စွန်းထင်းခြင်း (ပုံ. 7B') တွင် ကျွန်ုပ်တို့၏ vivo လေးလံသော mutants များနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို အသက်သွင်းခြင်းသည် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန် (ပုံ 7B၊ F) နှင့် AJ phenotypes (ပုံ 7B”) ကို သိသိသာသာ တိုးတက်စေသည်။ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများကို ဆဲလ်ဝိုင်းနေမှုအချိုး (CCR) အဖြစ် တွက်ချက်ပြီး အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အရေးပါမှုအတွက် နှိုင်းယှဉ်ထားသည် (ပုံ။ 7G)။အမှန်စင်စစ်၊ ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ (ပုံ။ 7G၊ CCR = 1.56) တွင် wortmannin ကုသမှုသည် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ကို သိသာထင်ရှားစွာ ပြောင်းလဲရန် လုံလောက်သည် (ပုံ။ 7G၊ CCR = 3.61၊ p < 2.4 × 10-9) လေ့လာတွေ့ရှိထားသည့် အတိုင်းအတာနှင့် ဆင်တူသည်။ SPECC1L တွင်-kd ဆဲလ်များ (ပုံ။ 7G၊ CCR = 3.46)။SPECC1L-kd ဆဲလ်များ၏ Wortmanin ကုသမှု (ပုံ။ 7G၊ CCR = 3.60၊ ပေါ့ပေါ့ပါးပါး) သည် မကုသရသေးသော kd ဆဲလ်များ (ပုံ။ 7G၊ CCR = 3.46၊ ပေါ့ပေါ့ပါးပါး) သို့မဟုတ် wortmannin ကုသထားသော ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များ (ပုံ။ 7G) ထက် ပိုသိသာသည်။, CCR = 3.46၊ ပေါ့ဆမှု) သည် ဆဲလ်ရှည်လျားမှုကို သက်ရောက်သည် (7G၊ CCR = 3.61၊ ပေါ့ပေါ့ပါးပါး)။အရေးအကြီးဆုံးမှာ၊ SC-79 AKT activator သည် SPECC1L-kd ဆဲလ်များ၏ ရှည်လျားသော ဖီနိုအမျိုးအစားကို ပြန်လည်ရရှိသည် (ပုံ။ 7G၊ CCR = 1.74၊ p < 6.2 × 10-12)။ဤရလဒ်များသည် SPECC1L သည် PI3K-AKT အချက်ပြမှုကို ထိန်းညှိပေးပြီး SPECC1L တွင် အလယ်အလတ်ကျဆင်းခြင်းသည် ဆဲလ်များ တွယ်ကပ်မှုကို သက်ရောက်စေပြီး ပြင်းထန်စွာကျဆင်းခြင်းသည် apoptosis (ပုံ 8) ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်ဟု အကြံပြုပါသည်။
(A–F') ထိန်းချုပ်မှု (A၊ C၊ E) နှင့် SPECC1L-kd (B, D, F) ဆဲလ်များကို PI3K-AKT လမ်းကြောင်း တားဆေး wortmannin (C, D) သို့မဟုတ် SC-79 activator (E, F) ဖြင့် ကုသခြင်း .မကုသရသေးသော ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များသည် ပုံမှန် β-cat ဆဲလ်များ စွန်းထင်းခြင်း (A') ဖြင့် cuboidal (A) ဖြစ်ပြီး၊ kd ဆဲလ်များသည် ရှည်လျားပြီး (B) ကို β-cat စွန်းထင်းခြင်း (B') တိုးလာပါသည်။PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို နှိမ်နင်းပြီးနောက်၊ ထိန်းချုပ်ထားသောဆဲလ်များသည် β-cat ချဲ့ထွင်ခြင်း (C') ဖြင့် ရှည်လျားသော (C) ကို ချဲ့ထွင်ပြီး kd ဆဲလ်များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ အလွန်ပြောင်းလဲသွားသော သန္ဓေသားလောင်းများနှင့် ဆင်တူသော kd ဆဲလ်များသည် apoptosis (D) ကို စတင်ခံစားရပြီး အလွန်ကောင်းမွန်သော β-cat ကို ပြသသည်။စွန်းထင်းခြင်း (D')။PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို အသက်သွင်းပြီးနောက်၊ ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များသည် cuboidal (E) နှင့် ပုံမှန် β-cat (E') စွန်းထင်းနေခဲ့ပြီး kd ဆဲလ်များသည် သိသိသာသာ တိုးတက်လာသော ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန် (F) နှင့် β-cat (F') စွန်းထင်းမှုကို ညွှန်ပြနေချိန်တွင်၊ (ဆ) (AF) ရှိ ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုဒီဂရီကို MetaMorph ဆော့ဖ်ဝဲလ်အသုံးပြု၍ အရှည်ဆုံးအတိုင်းအတာ (CCR) နှင့် ဆက်စပ်ဒေါင်လိုက်အတိုင်းအတာ (အနံ) တို့ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ထားသည်။မကုသရသေးသော (NT) SPECC1L-kd ဆဲလ်များ (CCR = 3.46) သည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များထက် သိသိသာသာ ပိုရှည်သည် (CCR = 1.56၊ p < 6.1 × 10–13)။ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များရှိ PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို Wort ၏ တားမြစ်ခြင်းသည် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်တွင် ဆင်တူသော ရှည်လျားမှုကို ဖြစ်စေသည် (CCR=3.61၊ p<2.4×10-9) လုံလောက်ပါသည်။အလားတူ၊ SPECC1L-kd ဆဲလ်များရှိ SC-79 မှ AKT ဖြင့် အသက်သွင်းခြင်းသည် ထိန်းချုပ်မှုအဆင့်သို့ ဆဲလ်ရှည်လျားမှုကို ပြန်လည်ရရှိသည် (CCR = 1.74၊ p < 6.2 × 10–12)။SPECC1L-kd ဆဲလ်များ၏ Wortmanin ကုသမှုသည် apoptosis တိုးလာသော်လည်း ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှု (CCR=3.60) သို့မဟုတ် မကုသရသေးသော kd (CCR=3.46၊ ns) သို့မဟုတ် wortmannin-treated control cells (3.61) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နောက်ထပ်တိုးလာခြင်းမရှိပါ။ns = အရေးမကြီးဘူး။ဆဲလ် 50 အတွက် +/- SEM တိုင်းတာမှုများကို ပြသထားသည်။Student's t-test ကို အသုံးပြု၍ ကိန်းဂဏန်းကွဲပြားမှုများကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။
(က) AJ အပြောင်းအလဲနှင့် ကယ်တင်ခြင်းတို့ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို တားဆီးခြင်းနှင့် အသက်သွင်းခြင်း၏ ဇယားကွက်ကို ကိုယ်စားပြုခြင်း။(ခ) SPECC1L မှ AKT ပရိုတင်းတည်ငြိမ်မှုအတွက် အဆိုပြုထားသော မော်ဒယ်။
Premigratory CNCC များသည် အရှေ့ဘက်အာရုံကြောခေါက် neuroepithelial ဆဲလ်များ 1,15,32 မှခွဲထုတ်ရန် AJ lysis လိုအပ်သည်။AJ အစိတ်အပိုင်းများ၏ စွန်းထင်းမှု တိုးလာခြင်းနှင့် SPECC1L-ဗီထရိုနှင့် vivo နှစ်ခုလုံးရှိ apical-basal AJ asymmetric ဖြန့်ဝေမှု ဆုံးရှုံးခြင်း ၊ SPECC1L ၏ β-catenin ၏ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ နီးစပ်မှုနှင့်အတူ SPECC1L ၏ လုပ်ဆောင်ချက်များသည် AJ ဒေသဆိုင်ရာ တည်ငြိမ်မှုကို ကောင်းမွန်စွာ ထိန်းသိမ်းရန် အကြံပြုထားသည်။ အဖွဲ့အစည်းကြွက်သား။actin cytoskeleton ။SPECC1L သည် actin cytoskeleton နှင့် β-catenin တို့နှင့် ဆက်စပ်နေပြီး SPECC1L မရှိခြင်းတွင် နို့ဆီလွှာအက်ဆစ် အရေအတွက် တိုးလာခြင်းသည် AJ ၏ သိပ်သည်းဆ တိုးလာသည်နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။နောက်ဖြစ်နိုင်ချေတစ်ခုကတော့ SPECC1L-ချို့တဲ့ဆဲလ်များရှိ actin အမျှင်အရေအတွက် တိုးလာခြင်းကြောင့် intercellular တင်းမာမှုကို ပြောင်းလဲစေသည်။ဆယ်လူလာဖိစီးမှုသည် AJ 33 ဒိုင်နနမစ်အပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသောကြောင့် ဗို့အားပြောင်းလဲမှုများသည် AJ 34 ကို ပိုမိုပျံ့နှံ့စေနိုင်သည်။ထို့ကြောင့် မည်သည့်ပြောင်းလဲမှုမဆို CNCC အလွှာများအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိမည်ဖြစ်သည်။
Wnt1 ကို အာရုံကြော ဆဲလ်များ ဖြစ်ပေါ်စေသည့် အစောပိုင်း အာရုံကြော ခေါက်များတွင် ဖော်ပြသည်။ထို့ကြောင့်၊ Wnt1-cre မျိုးရိုးခြေရာခံခြင်းသည် NCC35 အကြိုနှင့် ရွှေ့ပြောင်းခြင်းနှစ်ခုလုံးကို အမှတ်အသားပြုပါသည်။သို့သော်၊ Wnt1 သည် အစောပိုင်းအာရုံကြောခေါက် 35,36 မှဆင်းသက်လာသော dorsal ဦးနှောက်တစ်ရှူးများကို အမှတ်အသားပြုပေးသည်၊ ၎င်းသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ E9.5 mutants များ၏ Wnt1 အမှတ်အသားများအတွက် စွန်းထင်းနေသောအာရုံကြောခေါက်များတွင် CNCC မဟုတ်ပါ။NCC အမှတ်အသားများ AP2A နှင့် SOX10 အတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ အပြုသဘောဆောင်သော စွန်းထင်းမှုသည် Specc11 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသား၏ အာရုံကြောခြံများတွင် CNCC ပါ၀င်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ AP2A နှင့် SOX10 တို့သည် အစောပိုင်းရွှေ့ပြောင်းခြင်း NCC ၏ အမှတ်အသားများဖြစ်သောကြောင့်၊ ဤဆဲလ်များသည် E9.5 ဖြင့် stratified မရနိုင်သော ရွေ့ပြောင်းမှုလွန် CNCC ဖြစ်ကြောင်း အပြုသဘောဆောင်သော စွန်းထင်းမှုမှ ဖော်ပြသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များအရ SPECC1L မှ AJ ၏ မော်လီကျူးစည်းမျဥ်းအား PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းဖြင့် ဖျန်ဖြေပေးကြောင်း အကြံပြုအပ်ပါသည်။SPECC1L ချို့တဲ့သောဆဲလ်များနှင့် တစ်ရှူးများတွင် AKT အချက်ပြခြင်းကို လျှော့ချသည်။Fantauzzo et al မှတွေ့ရှိချက်များ။craniofacial morphogenesis တွင် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းအတွက် တိုက်ရိုက်အခန်းကဏ္ဍကို ပံ့ပိုးပေးသည်။PDGFRα အခြေပြု PI3K-AKT အချက်ပြခြင်း၏ အသက်ဝင်မှု မရှိခြင်းက အာခေါင်ကွဲ phenotype ကို ဖြစ်စေသည်ဟု (2014) က ပြသခဲ့သည်။PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို ဟန့်တားခြင်းသည် U2OS ဆဲလ်ရှိ AJ နှင့် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ကို ပြောင်းလဲရန် လုံလောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏တွေ့ရှိချက်များနှင့်အညီ Cain et al.37 သည် endothelial ဆဲလ်များရှိ PI3K α110 subunit ၏စည်းမျဉ်းကိုလျှော့ချခြင်းသည် pericellular β-catenin စွန်းထင်းမှုကို "ချိတ်ဆက်မှုအညွှန်းကိန်း" တိုးလာသည်ဟုရည်ညွှန်းသည့် pericellular β-catenin တွင်အလားတူတိုးလာကြောင်းပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ actin အမျှင်များသည် အလွန်ဖွဲ့စည်းထားပြီးဖြစ်သော endothelial ဆဲလ်များတွင် PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို ဖိနှိပ်ခြင်းသည် လျော့ရဲသောဆဲလ်ပုံစံဖြစ်လာသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ SPECC1L-kd U2OS ဆဲလ်များသည် ရှည်လျားသောဆဲလ်ပုံစံကို ပြသခဲ့သည်။ဤခြားနားချက်သည် ဆဲလ်အမျိုးအစားသီးသန့်ဖြစ်နိုင်သည်။PI3K-AKT အချက်ပြမှုအား ဖိနှိပ်ခြင်းသည် actin cytoskeleton ကို အပြီးအပိုင် သက်ရောက်မှုရှိသော်လည်း၊ ဗဟို actin အမျှင်များ၏ သိပ်သည်းဆနှင့် ဖွဲ့စည်းမှုဆိုင်ရာ အပြောင်းအလဲများကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော တင်းမာမှုပြောင်းလဲမှုများကြောင့် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်အပေါ် သက်ရောက်မှုကို ဆုံးဖြတ်ပါသည်။U2OS ဆဲလ်များတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် SPECC1L-ချို့တဲ့သော AJ ပြောင်းလဲမှုနှင့် ပြန်လည်ရယူခြင်း၏ အမှတ်အသားအဖြစ် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများကိုသာ အသုံးပြုခဲ့သည်။နိဂုံးချုပ်အနေဖြင့်၊ SPECC1L ချို့တဲ့မှုတွင် AKT လမ်းကြောင်းကို ဟန့်တားခြင်းသည် AJ တည်ငြိမ်မှုကို တိုးစေပြီး CNCC တွင် delamination လျော့နည်းစေသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။
စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ pan-AKT အဆင့်များသည် AKT ပရိုတင်းတည်ငြိမ်မှု သို့မဟုတ် အချိုးအကွေ့အဆင့်တွင် PI3K-AKT အချက်ပြခြင်းဆိုင်ရာ စည်းမျဉ်းများကို အကြံပြုထားသည့် SPECC1L မရှိသည့် phosphorylated 473-AKT အဆင့်များအပြင် vivo နှင့် vivo တို့တွင် လျော့သွားခဲ့သည်။Opitz/GBBB ရောဂါလက္ခဏာစုနှင့်ဆက်စပ်နေသော SPECC1L နှင့် MID1 ဗီဇနှစ်ခုလုံးသည် microtubules 18,22 ကို တည်ငြိမ်စေသော ပရိုတင်းများကို ကုဒ်နံပါတ်ပေးသည်။SPECC1L နှင့် MID1 သည် microtubule stabilization ကို ပြေလည်အောင်ဆောင်ရွက်ပေးသည့် ယန္တရားကို အပြည့်အဝနားမလည်ပါ။SPECC1L ၏အခြေအနေတွင်၊ ဤတည်ငြိမ်မှုသည် microtubules 18 ၏ အပိုင်းခွဲတစ်ခု၏ ပိုမိုကောင်းမွန်သော acetylation ပါဝင်သည်။SPECC1L သည် AKT ကဲ့သို့သော အခြားပရိုတင်းများကို တည်ငြိမ်စေရန် အလားတူယန္တရားကို အသုံးပြု၍ ဖြစ်နိုင်သည်။AKT ပရိုတင်းရှိ lysine အကြွင်းအကျန်များ၏ acetylation သည် membrane localization နှင့် phosphorylation 38 ကိုလျော့ကျစေကြောင်းပြသထားသည်။ထို့အပြင်၊ K63 ကွင်းဆက်အား AKT ရှိ တူညီသော lysine အကြွင်းအကျန်တွင် နေရာအနှံ့ ပျံ့နှံ့စေရန်အတွက် ၎င်း၏အမြှေးပါးကို ဒေသပြောင်းလဲခြင်းနှင့် အသက်ဝင်စေခြင်း 39,40 လိုအပ်ပါသည်။SPECC1L ပရိုတင်းများနှင့် တုံ့ပြန်သည့်အချက်များစွာတွင် အမျိုးမျိုးသော မြင့်မားသောထွက်ရှိနိုင်သော တဆေးနှစ်မျိုးစပ်ဖန်သားပြင်များတွင် ဖော်ပြထားသော လေးခု- CCDC841၊ ECM2942၊ APC နှင့် UBE2I43 - သည် နေရာအနှံ့ပျံ့နှံ့ခြင်း သို့မဟုတ် sumoylation မှတစ်ဆင့် ပရိုတိန်းအလှည့်အပြောင်း သို့မဟုတ် တည်ငြိမ်မှုတွင် ဆက်စပ်နေပါသည်။SPECC1L သည် AKT တည်ငြိမ်မှုကို ထိခိုက်စေသော AKT lysine အကြွင်းအကျန်များကို ဘာသာပြန်ပြီးနောက် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုတွင် ပါဝင်နိုင်သည်။သို့ရာတွင်၊ AKT ပရိုတင်း၏ တည်နေရာပြောင်းလဲခြင်းနှင့် တည်ငြိမ်မှုတွင် SPECC1L ၏ အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍကို ရှင်းလင်းဖော်ပြရန် ကျန်ရှိနေပါသည်။
vivo ရှိ SPECC1L ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုတွင် ပြင်းထန်သောချို့ယွင်းချက်များသည် AJ အမှတ်အသား စွန်းထင်းမှုနှင့် CNCC ထပ်ဆင့်မှု တိုးမြှင့်ခြင်းအပြင် apoptosis နှင့် အစောပိုင်းသန္ဓေသားသေဆုံးမှုတို့ကို တိုးလာစေပါသည်။apoptosis အဆင့်တိုးမြင့်လာသော ကြွက် mutants များသည် အာရုံကြောပြွန်ချို့ယွင်းမှု 44,45,46,47 နှင့် craniofacial defects48 တို့နှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ယခင်အစီရင်ခံစာများက ဖော်ပြခဲ့သည်။အာရုံကြောခေါက်များ သို့မဟုတ် pharyngeal arches များတွင် အလွန်အကျွံ ဆဲလ်သေခြင်းသည် သင့်လျော်သော morphogenetic လှုပ်ရှားမှု 48,49,50 အတွက် လိုအပ်သော ဆဲလ်အရေအတွက် မလုံလောက်မှု ဖြစ်ပေါ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ SPECC1L ချို့တဲ့သောဆဲလ်လိုင်းများသည် အတန်အသင့်လျှော့ချထားသော SPECC1L ဖော်ပြချက်ဖြင့် ဆဲလ်သေခြင်းဆိုင်ရာ အထောက်အထားမရှိဘဲ AJ အပြောင်းအလဲများကိုသာ ပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ ဤ Kd ဆဲလ်များရှိ PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို ဓာတုဗေဒနည်းအရ ဟန့်တားခြင်းသည် apoptosis တိုးလာစေသည်။ထို့ကြောင့်၊ SPECC1L ဖော်ပြချက် သို့မဟုတ် လုပ်ဆောင်မှုတွင် အလယ်အလတ် ကျဆင်းခြင်းသည် ဆဲလ်များရှင်သန်မှုကို သေချာစေသည်။၎င်းသည် စိန့်တွင် ဖမ်းဆီးခြင်းမှ လွတ်ကင်းသော ရှားပါး Specc11 မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားကို လေ့လာတွေ့ရှိချက်နှင့် ကိုက်ညီသည်။E9.5—ဖြစ်နိုင်သည် လျော့နည်းသွားသော မျိုးရိုးဗီဇ ဖမ်းယူနိုင်မှု ကြောင့်—ဖြစ်ကောင်း ဖြစ်နိုင်သည်မှာ- ၎င်းတို့၏ အာရုံကြောပြွန်များကို ပိတ်ပြီး နောက်ပိုင်းတွင် မကြာခဏ အရေပြားဆိုင်ရာ ချို့ယွင်းချက်များ ဖြင့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို ရပ်တန့်နိုင်သည် (ပုံ။ S3)။ဤအချက်နှင့်လည်း ကိုက်ညီသည်မှာ craniofacial မူမမှန်မှုများရှိသည့် heterozygous Specc1l သန္ဓေသား၏ ရှားရှားပါးပါး ပေါ်ပေါက်ခြင်း—မျိုးရိုးဗီဇ ဖမ်းယူနိုင်မှု တိုးမြှင့်မှုကြောင့် ဖြစ်ကောင်းဖြစ်နိုင်သည်—အပြင် SPECC1L orthologues (specc1lb) သည် နှောင်းပိုင်းတွင် သန္ဓေတည်ခြင်းမျိုးများကို ဖြစ်စေသည့် ကျားဘရာငါးတွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းလည်း ဖြစ်သည်။ အောက်မေးရိုးနှင့် နှစ်ဘက်အကွဲများ ၅၁။ထို့ကြောင့်၊ လူသားလူနာများတွင်တွေ့ရှိရသော လုပ်ဆောင်ချက်ဆုံးရှုံးမှုမျိုးကွဲ SPECC1L သည် SPECC1L လုပ်ငန်းဆောင်တာအတွင်း သေးငယ်သောချို့ယွင်းချက်ဖြစ်စေနိုင်သည်၊ ၎င်းတို့၏ orofacial clefts များကို ရှင်းပြရန် လုံလောက်ပါသည်။SPECC1L-based intercellular contacts များ၏ စည်းမျဉ်းသည် palatogenesis နှင့် pharyngeal arches များ၏ ပေါင်းစပ်မှုတွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်နိုင်ပါသည်။SPECC1L လုပ်ဆောင်ချက်၏ နောက်ထပ်လေ့လာမှုများသည် အာရုံကြောပြွန်ပိတ်နေစဉ်အတွင်း CNCC ရှိ ယာယီ intercellular အဆက်အသွယ်များ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ရှင်းလင်းစွာ ထောက်ကူပေးမည်ဖြစ်ပါသည်။
U2OS osteosarcoma ထိန်းချုပ်မှုနှင့် SPECC1L-kd ဆဲလ်များကို ယခင်က ဖော်ပြခဲ့သည် (Saadi et al., 2011)။SPECC1L နှင့် ဆန့်ကျင်သည့် ပဋိပစ္စည်းများကိုလည်း ယခင်က လက္ခဏာရပ်များ (Saadi et al., 2011)။Anti-β-catenin ပဋိပစ္စည်း (ယုန်; 1:1000; Santa Cruz၊ Dallas, TX) (မောက်စ်; 1:1000; ဆဲလ်အချက်ပြနည်းပညာ၊ Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich၊ စိန့်လူးဝစ် ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego ကယ်လီဖိုးနီးယား), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ခွာထားသော caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) နှင့် β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich၊ St. Louis၊ MO) ကို ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အသုံးပြုခဲ့သည်။.Actin အမျှင်များသည် Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado) ဖြင့် စွန်းထင်းခဲ့သည်။
U2OS ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များနှင့် SPECC1L-kd ဆဲလ်များကို 10% သန္ဓေသား၏သွေးရည်ကြည် (Life Technologies, Carlsbad, CA) ဖြင့် စံမြင့်မားသော ဂလူးကို့စ် DMEM တွင် မွေးမြူထားသည်။AJ ပြောင်းလဲမှုများအတွက် 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ဖြင့် ကုသထားသော ဖန်ခွက်ပေါ်တွင် ဆဲလ် 2 x 105 ကို အစေ့ထုတ်ပြီး ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများအတွက် စောင့်ကြည့်လေ့လာခဲ့သည်။ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန် မပြောင်းလဲဘဲ ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန် (t=3)၊ ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲခြင်း (t=4)၊ ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲခြင်း (t=4)၊ , 24 h ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုပြီးနောက် (t = 5) နှင့် 48 h ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုပြီးနောက် (t = 6) (ပုံ။ 1, 2, 3) ။PI3K-AKT လမ်းကြောင်းကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲရန်၊ ဆဲလ်များကို PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences၊ Minneapolis၊ Minnesota) သို့မဟုတ် SC-79 activator (TOCRIS Biosciences၊ Minneapolis Adams၊ Minnesota) ဖြင့် ညွှန်ပြသော ပြင်းအားများဖြင့် မွေးမြူထားသည်။ဓာတုပစ္စည်းများပါဝင်သော ကြားခံကိုနေ့စဉ်ပြောင်းလဲခဲ့သည်။
တစ်ဖရိမ်အလိုက် အသံဖမ်းယူမှုများကို တိုက်ရိုက်ထိန်းချုပ်မှုနှင့် KD ဆဲလ်များကို ပုံမှန်ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေများအောက်တွင် ပြုလုပ်ထားပြီး အဆင့်ဆန့်ကျင်ဘက်ပုံများကို 10 မိနစ်တိုင်း 7 ရက်ကြာ စုဆောင်းထားသည်။စက်ပိုင်းဆိုင်ရာအဆင့်နှင့် QImaging Retiga-SRV ကင်မရာနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော 10 × N-PLAN ရည်မှန်းချက် တပ်ဆင်ထားသော ကွန်ပျူတာ-ထိန်းချုပ်ထားသော Leica DM IRB ရောင်ပြန်အဏုကြည့်မှန်ခရိုစကုပ်ကို အသုံးပြု၍ ဓာတ်ပုံများကို ရယူခဲ့သည်။ပုံရိပ်ဖော်နေစဉ်အတွင်း၊ ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုများကို 37°C တွင် စိုစွတ်သောလေထုတွင် CO2 5% ဖြင့် ထိန်းသိမ်းထားသည်။
Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) မှ ES ဆဲလ်လိုင်းများ DTM096 နှင့် RRH048 နှစ်ခုကို Specc11 ချို့တဲ့မောက်စ်လိုင်းများ ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် သတ်မှတ်ထားသော Specc1lgtDTM096 နှင့် Specc1lgtRRH046 ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ 129/REJ ES ဆဲလ်များကို C57BL6 blastocysts အတွင်းသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။Agouti ကုတ်အင်္ကျီအရောင်ဖြင့် သားစဉ်မြေးဆက်ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် ရလဒ်ထွက်ရှိသော chimeric အထီးကြွက်များကို အမျိုးသမီး C57BL6 ကြွက်များဖြင့် မွေးမြူခဲ့သည်။မျိုးရိုးဗီဇထောင်ချောက် vector inserts များပါဝင်မှုကို heterozygotes ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အသုံးပြုခဲ့သည်။ကြွက်များကို 129/REJ;C57BL6 ရောနှောထားသော နောက်ခံတွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။မျိုးရိုးဗီဇထောင်ချောက် vector ၏ထည့်သွင်းသည့်နေရာတည်နေရာကို RT-PCR၊ genome sequencing နှင့် genetic complementation (နောက်ဆက်တွဲပုံ 1) ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။နှစ်ထပ်မျိုးကွဲ Specc1lGT ကြွက်များ၏ CNCC မျိုးရိုးကို ခြေရာခံရန်၊ ROSAmTmG (#007576) နှင့် Wnt1-Cre (#003829) ကြွက်များ (Jackson Laboratory၊ Bar Harbor, ME) ကို ROSAmTmG နှင့် Wnt1-Cre allele ကြွက်များထုတ်လုပ်ရန် ဖြတ်ကျော်ခဲ့သည်။ Spectrum တွင်University of Kansas Medical Center ၏ Institutional Animal Care and Use Committee မှ အတည်ပြုထားသော ပရိုတိုကောများအတိုင်း ကြွက်များတွင် စမ်းသပ်မှုအားလုံးကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။
သန္ဓေသားလောင်းကို အခန်းအပူချိန်တွင် (1% formaldehyde၊ 0.2% glutaraldehyde၊ 2 mM MgCl2၊ 0.02% NP-40၊ 5 mM EGTA) တွင် အခန်းအပူချိန်တွင် 60 မိနစ်ကြာ ပြုပြင်ပေးသည်။X-gal staining solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) အစွန်းအထင်းများကို 37°C တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ .1-6 နာရီအတွင်း°C။သန္ဓေသားလောင်းများကို 4% PFA တွင် အပြီးပြုပြင်ပြီး မြင်ယောင်လာသည်။
အနောက်တိုင်း ပိတ်ဆို့ခြင်းအတွက်၊ ဆဲလ်များကို HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) နှင့် ဖြည့်စွက်ထားသော passive lysis ကြားခံ (Promega, Fitchburg, WI) တွင် lyse လုပ်ထားသည်။Lysates သည် 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX အဆင်သင့်လုပ် gels (Bio-Rad, Hercules, CA) တွင် လုပ်ဆောင်ပြီး Immobilon PVDF အမြှေးပါးများ (EMD Millipore, Billerica, MA) သို့ လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။0.1% Tween ပါရှိသော PBS တွင် 5% နို့အမြှေးပါးများကိုပိတ်ဆို့ခဲ့သည်။ပဋိပစ္စည်းများကို 4°C တွင် တစ်ညလုံး သို့မဟုတ် အခန်းအပူချိန်တွင် တစ်နာရီကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။Femto SuperSignal West ECL ဓာတ်ပစ္စည်းများ (Thermo Scientific၊ Waltham၊ MA) ကို အချက်ပြထုတ်လုပ်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ခုခံအားထိန်းခြင်းအတွက်၊ သန္ဓေသားလောင်းများကို 4% PFA/PBS ဖြင့် တစ်ညလုံး ပြုပြင်ပြီး cryopreserved လုပ်ထားသည်။ပုံမှန်ဆိတ်သွေးရည်ကြည် (Thermo Scientific၊ Waltham, MA) နှင့် 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ပါဝင်သော ပုံမှန်ဆိတ်သွေးရည်ကြည် 1% ပါဝင်သော PBS တွင် ပိတ်ဆို့ပြီး ဖောက်ထုတ်သည့်ကာလအတွင်း 4°C တွင် ပေါက်ဖွားသည်။ ည။Anti-antibody နှင့် fluorescent secondary antibody (1:1000) ဖြင့် 4°C တွင် 1 နာရီကြာ။စွန်းထင်းနေသောအပိုင်းများကို ProLong ရွှေအလတ်စား (Thermo Scientific၊ Waltham MA) တွင် ထားရှိခဲ့ပြီး အပြားလိုက်ပုံများကို Leica TCS SPE confocal microscope ကို အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့သည်။ခုခံအားစနစ်တစ်ခုစီကို အနည်းဆုံး မျိုးပြောင်းသန္ဓေသားနှစ်ခု၏ ခွဲခြမ်းစိပ်ဖြာမှုတွင် သီးခြားလွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှု သုံးခုအဖြစ် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ကိုယ်စားပြုစမ်းသပ်မှုတစ်ခုကို ပြသထားသည်။
ဆဲလ်များကို ပြုပြင်ထားသော RIPA ကြားခံ (20 mM Tris-HCl၊ pH 8.0၊ 1% NP-40၊ 130 mM NaCl၊ 10% glycerol၊ 2 mM EDTA နှင့် HALT ပရိုတိန်းတားဆေး (Sigma-Aldrich၊ St. Louis, MO)) အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ lysates ကို ပရိုတိန်း G သံလိုက်ပုတီးစေ့များ (Life Technologies, Carlsbad, CA) ဖြင့် ကြိုတင်သန့်စင်ပြီး 4°C တွင် တစ်ညလုံးပေါက်ဖွားသည်။ SPECC1L သို့မဟုတ် IgG ပရိုတိန်းဆန့်ကျင်သည့် G ပရိုတိန်းပုတီးစေ့များကို SPECC1L ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးပြုပြီး အနောက်တိုင်း ပိတ်ဆို့ခြင်းကို ဆန့်ကျင်သည့်ဆေးကို အသုံးပြုထားသည်။ အထက်တွင်ဖော်ပြထားသော -β-catenin ပဋိပစ္စည်းကို ပြသထားသော ပူးတွဲ IP စမ်းသပ်မှုများသည် သီးခြားလွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှုလေးခုကို ကိုယ်စားပြုပါသည်။
Kansas ဆေးဘက်ဆိုင်ရာစင်တာရှိ University of Kansas Medical Center ရှိ အီလက်ထရွန်အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းစင်တာသို့ ပြုပြင်ထားသော ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာဆဲလ်များ သို့မဟုတ် ကြွက်သန္ဓေသားတစ်ရှူးများကို ထောက်ပံ့ပေးခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ နမူနာများကို EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) တွင် မြှုပ်နှံထားပြီး 60°C တွင် တစ်ညလုံး ပေါ်လီမာပြုလုပ်ပြီး စိန်ဓါးဖြင့် တပ်ဆင်ထားသော Leica UC7 ultramicrotome ကို အသုံးပြု၍ 80 nm တွင် ပိုင်းခြားထားသည်။100 kV Lab6 သေနတ် တပ်ဆင်ထားသော JEOL JEM-1400 ဂီယာအီလက်ထရွန် အဏုစကုပ်ကို အသုံးပြု၍ အပိုင်းများကို ပုံဖော်ထားသည်။
ဤဆောင်းပါးကို ကိုးကားနည်း- Wilson, NR et al.SPECC1L ချို့တဲ့ခြင်းသည် အဆစ်အဆစ်များ၏ တည်ငြိမ်မှုကို တိုးလာစေပြီး cranial neural crest cells များ၏ ကွဲထွက်မှုကို လျော့နည်းစေသည်။သိပ္ပံပညာ။6, 17735;doi-10.1038/srep17735 (2016)။
Saint-Jeanne, J.-P.အာရုံကြောအမောက်၏ လှုံ့ဆော်မှုနှင့် ကွဲပြားမှု။(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com၊ 2006)။
Cordero, DR et al.Cranial neural crest cells ရွေ့လျားမှု- craniofacial development တွင် ၎င်းတို့၏ အခန်းကဏ္ဍ။American Journal of Medical Genetics။အပိုင်း A 155A၊ 270–279၊ doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011)။
Boland, RP Neurocristopathia: ၎င်း၏တိုးတက်မှုနှင့် 20 နှစ်ကျော်တိုးတက်မှု။ကလေးအထူးကု။ရောဂါဗေဒ။စမ်းသပ်ခန်း။ဆေးဝါး။၁၇၊ ၁–၂၅ (၁၉၉၇)။
Mangold E., Ludwig KU နှင့် Noten MM သည် orofacial clefts ၏ မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ အောင်မြင်မှု။မော်လီကျူးဆေးပညာဆိုင်ရာ လမ်းကြောင်းများ 17၊ 725–733၊ doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011)။
Minu၊ M. နှင့် Riley၊ FM မော်လီကျူးယန္တရားများသည် ဦးနှောက်အာရုံကြော အမောက်ဆဲလ်များ ရွှေ့ပြောင်းခြင်းနှင့် မျက်နှာအရေပြား ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွင်း ပုံစံချခြင်း ဖြစ်သည်။ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု 137၊ 2605–2621၊ doi: 10.1242/dev.040048 (2010)။
Dixon၊ MJ၊ Marazita၊ ML၊ Beaty၊ TH နှင့် Murray၊ JK နှုတ်ခမ်းနှင့် အာခေါင်ကွဲ- မျိုးရိုးဗီဇနှင့် ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ လွှမ်းမိုးမှုများကို နားလည်ခြင်း။သဘာဝမှတ်ချက်။မျိုးရိုးဗီဇ 12၊ 167–178၊ doi: 10.1038/nrg2933 (2011)။
အင်ဂရမ်၊ CR et al။interferon-regulating factor-6 (Irf6)-ချို့တဲ့သော ကြွက်များတွင် အရေပြား၊ ခြေလက်များနှင့် craniofacial ဒေသတို့၏ ပုံမှန်မဟုတ်သော ဇီဝရုပ်ဖြစ်ပျက်မှု။အမျိုးသား Genette၃၈၊ ၁၃၃၅–၁၃၄၀၊ doi: 10.1038/ng1903 (2006)။
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3 တွင် ကြီးစိုးသော ဗီဇပြောင်းလဲမှုများသည် Van der Waord ရောဂါစုကို ဖြစ်စေပြီး ခံတွင်း periderm ဖွံ့ဖြိုးမှုကို ထိခိုက်စေသည်။Am J Hum Genet 94၊ 23–32၊ doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)။
Harris၊ MJ နှင့် Juriloff၊ DM သည် အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းတွင် ချို့ယွင်းချက်ရှိသော mouse mutants စာရင်းကို အပ်ဒိတ်လုပ်ပြီး အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းကို ပြီးပြည့်စုံသော မျိုးရိုးဗီဇနားလည်မှုဆီသို့ တိုးတက်မှုဆီသို့ ဦးတည်သွားပါသည်။မွေးရာပါ ချို့ယွင်းချက်များကို စစ်ဆေးခြင်း။အပိုင်း A၊ Clinical and Molecular Teratology 88၊ 653–669၊ doi: 10.1002/bdra.20676 (2010)။
Fantauzzo၊ KA နှင့် Soriano၊ P. PI3K-ဖျန်ဖြေပေးထားသော PDGFRalpha အချက်ပြမှုသည် p53-မူတည်သော အတွင်းဆဲလ်လမ်းကြောင်းမှတဆင့် ရှင်သန်မှုနှင့် အရိုးကြီးထွားမှုကို ထိန်းညှိပေးသည်။ဗီဇဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု 28၊ 1005–1017၊ doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014)။
Kopp၊ AJ၊ Green၊ ND နှင့် Murdoch၊ JN Disheveled- အာရုံကြောပြွန်ပိတ်ခြင်းနှင့် ပေါင်းစည်းချဲ့ထွင်ခြင်းဆိုင်ရာ ဆက်စပ်မှု။အာရုံကြောဗေဒဆိုင်ရာလမ်းကြောင်းများ။26၊ 453–455၊ doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)။