347 stainless steel coiled tubing ဓာတုအစိတ်အပိုင်း၊ interferon-responsive human leukocyte antigen-A (HLA-A) chaperone ပရိုတင်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း cross-linked mass spectrometry (CLMS)

Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။
ဆလိုက်တစ်ခုလျှင် ဆောင်းပါးသုံးပုဒ်ကို ပြသသည့် ဆလိုက်ဒါများ။ဆလိုက်များတစ်လျှောက် ရွှေ့ရန် နောက်ဘက်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် ဆလိုက်တစ်ခုစီကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ထိန်းချုပ်မှုခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။

ကုန်ပစ္စည်းအကြောင်းအရာ

Stainless Steel 347L Coil Tubes၊ Steel Grade: SS347L

အင်တာဖာရွန် အချက်ပြစနစ်သည် ပတ်ဝန်းကျင်မှ ရောဂါဖြစ်ပွားစေသော နှင့် ပင်ကိုယ်ရောဂါဆိုင်ရာ အချက်ပြမှုများစွာအတွက် ပြင်းထန်သော cytokine တုံ့ပြန်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးကာ interferon-inducible ပရိုတိန်း၏ အစုခွဲများကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် interferon-induced ပရိုတိန်းများ၏ဒိုမိန်းရှိ ပရိုတိန်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအသစ်များကို ရှာဖွေရန် DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။မျှော်မှန်းထားသော interferon-inducible ပရိုတင်းများအပြင်၊ MX1၊ USP18၊ OAS3 နှင့် STAT1 ကဲ့သို့သော canonical interferon-inducible ပရိုတင်းများ၏ ဆန်းသစ်သော interferon နှင့် intramolecular cross-linked adducts များကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် HLA-A ပရိုတင်းများ (H2BFS-HLA-A-HMGA1) မှဖွဲ့စည်းထားသော interferon-inducible ပရိုတိန်းကွန်ရက်များ၏ ထောင့်မှန်အတည်ပြုချက်အပေါ် အာရုံစူးစိုက်ထားပြီး co-immunoprecipitation နှင့် ၎င်းတို့၏နောက်ထပ်လေ့လာမှုကို မော်လီကျူးဒိုင်းနမစ်ပုံစံဖြင့် ပုံဖော်ထားသည်။ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးမှု၏ ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲနေသောပုံစံကို ပုံဖော်ခြင်းသည် CLMS တွေ့ရှိချက်များတွင် ဖော်ပြထားသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ထင်ဟပ်စေသည့် အပြန်အလှန်အကျိုးပြုသည့်နေရာအများအပြားကို ဖော်ထုတ်ပြသခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် interferon မှဖြစ်ပေါ်စေသောအချက်ပြမှုဆိုင်ရာရှုပ်ထွေးမှုများကိုဖော်ထုတ်ရန်အတွက် CLMS ၏ရှေ့ပြေးလေ့လာမှုတစ်ခုကိုတင်ပြကာ CLMS ၏ပိုမိုကျယ်ပြန့်သောအသုံးပြုမှုကိုရှာဖွေရန်အတွက်အကျိတ်အသေးစားပတ်ဝန်းကျင်ရှိပရိုတိန်းတုံ့ပြန်မှုများ၏ဒိုင်းနမစ်အသစ်များကိုဖော်ထုတ်ရန်မျှော်လင့်ပါသည်။
လိုက်လျောညီထွေရှိသော ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုတစ်ခုမစတင်မီ၊ အိမ်ရှင်၏မွေးရာပါကာကွယ်ရေးစနစ်သည် interferons (IFNs) ဟုခေါ်သော လျှို့ဝှက်အယ်လ်ဖာဟယ်လီကယ်ဆိုက်တိုကင်းမိသားစုတစ်စုမှ ဖျန်ဖြေပေးထားသည့် ပဋိဇီဝပိုးသတ်ဆေးတုံ့ပြန်မှုတစ်ခု တိုးလာသည်။အမျိုးအစား I IFN အတန်းများတွင် IFNα နှင့် IFNβ သည် ဗိုင်းရပ်စ်၊ ပရိုပိုတိုတစ်၊ ရောင်ရမ်းမှု၊ နှင့် မျိုးပွားမှုဆန့်ကျင်သော အခြေအနေများအပါအဝင် ဆဲလ်လူလာတုံ့ပြန်မှုများကို အသက်သွင်းသည်။လူသားများတွင် IFNα အမျိုးအစားခွဲ 13 ခုကို ခရိုမိုဆုန်း 91 တွင် အစုလိုက်အပြုံလိုက် လူသိများသည်။ အံ့သြစရာကောင်းသည်မှာ IFNα2 ကိုသာ လက်တွေ့အသုံးပြုရန် လေ့လာခဲ့သည်။မကြာသေးမီက IFNα ၏ အခြားအမျိုးအစားခွဲများကို သုတေသနပြုရန် အထူးအာရုံစိုက်ခဲ့သည်။မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုက IFNα14 သည် HBV2 နှင့် HIV-13,4 မျိုးပွားခြင်းကို ကန့်သတ်ခြင်းအတွက် အထိရောက်ဆုံး isoforms များထဲမှ တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်မှာ canonical IFNα2 အမျိုးအစားခွဲဖြစ်သည်။
activated type I interferon receptor complexes (IFNAR1 နှင့် IFNAR2) သည် Janus kinases TYK2 နှင့် JAK15,6 တို့မှ ဖျန်ဖြေပေးထားသော signal transduction cascade ကို အစပျိုးစေသည်ဟု တည်ထောင်ထားပါသည်။ဤ Janus kinases phosphorylate signal transducers နှင့် transcriptional protein activators (STAT1 နှင့် STAT2) တို့သည် SH2 domain-mediated heterodimerization6 ကိုစတင်ရန်အတွက် tyrosine အကြွင်းအကျန်များပေါ်ရှိ STAT1 နှင့် STAT2 တို့ဖြစ်သည်။နောက်ပိုင်းတွင် IRF9 သည် STAT heterodimers များကို နျူကလိယသို့ပြောင်းကာ 2000 ကျော် interferon-stimulated genes (ISGs) 5,6,7,8 ၏ IFN-လှုံ့ဆော်သည့်အချက် 3 ဗီဇ (ISGF3) ၏ trimeric complex ကိုဖွဲ့စည်းရန် ပေါင်းစပ်ထားသည်။
အထူးသဖြင့် ဗိုင်းရပ်စ်တိုက်ခိုက်မှုကို တုံ့ပြန်ရာတွင် ISG များသည် မွေးရာပါကိုယ်ခံအားစနစ်၏ ကျောရိုးဖြစ်သည်။ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်မှုကို ခုခံကာကွယ်သည့် ပထမမျဉ်းအနေဖြင့်၊ ဆဲလ်များသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်မှုများစွာဖြင့် ဆဲလ်လူလာပရိုတင်းများ၏ ကျယ်ပြန့်သော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို လျင်မြန်စွာ အသုံးချသည်။ဤပရိုတိန်းများတွင် ပုံစံအသိအမှတ်ပြု receptors၊ အချက်ပြမော်လီကျူးများ၊ ကူးယူဖော်ပြသည့်အချက်များ၊ နှင့် တိုက်ရိုက်ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်ချက်များပါရှိသော ပရိုတင်းများအပြင် ခုခံအားတုံ့ပြန်မှု၏အပျက်သဘောဆောင်သော ထိန်းညှိမှုများ ပါဝင်ပါသည်။ISG လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ အချက်အလက်အများစုသည် overexpression screens10,11 သို့မဟုတ် gene silenting techniques (siRNA, RNAi နှင့် CRISPR)12,13 ကိုအသုံးပြုသည့် functional screens များမှ လာပါသည်။ဤလေ့လာမှုများသည် ISG တစ်ခုချင်းစီ၏ ဗိုင်းရပ်စ်ဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများကို ဆုံးဖြတ်ထားသော်လည်း ISG တစ်ခုစီ၏ နောက်ခံ မော်လီကျူးယန္တရားများကို သိသိသာသာ မသိရှိနိုင်ပါ။ပရိုတင်းအများအပြားသည် အပြည့်အဝလုပ်ဆောင်မှုကိုသေချာစေရန် cytokines တစ်ခု သို့မဟုတ် တစ်ခုထက်ပိုသော cytokines နှင့် အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှုရှိသောကြောင့် ISG များသည် တိုက်ရိုက် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်ကြသည် သို့မဟုတ် ၎င်းတို့၏ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ဆဲလ်လူလာပရိုတင်းများဖြင့် ဖျန်ဖြေပေးပါသည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ မကြာသေးမီက photocrosslinked proteomics လေ့လာမှုတစ်ခုမှ ATPase VCP/p97 သည် အဓိက IFITM3 အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုလုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်အဖြစ် သတ်မှတ်ဖော်ပြခဲ့ပြီး ယင်းကို တားဆီးခြင်းသည် lysosomal အမျိုးအစားခွဲခြင်း၊ လွှဲပြောင်းခြင်းနှင့် ဗိုင်းရပ်စ်အမှုန်များနှင့်အတူ IFITM3 ၏ ပူးပေါင်းပို့ဆောင်ခြင်းတွင် ချို့ယွင်းချက်များဖြစ်ပေါ်စေသည်။immunoprecipitation ကိုအသုံးပြု၍ ကိုလက်စထရော-ဖျော့ဖျော့ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးများ ရင့်ကျက်မှုကို ပြေလည်အောင်ဆောင်ရွက်ပေးသည့် IFITM1/2/3 နှင့် အပြန်အလှန်ဆက်ဆံဖော်အဖြစ် VAPA ကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး yeast two-hybrid system ကိုအသုံးပြုကာ အခြားလေ့လာမှုမှ အတည်ပြုခဲ့ပါသည်။သိပ္ပံနည်းကျ ပံ့ပိုးမှု ၁၅၊ ၁၆။
ရောဂါပိုးကို နှိမ်နင်းခြင်းနှင့် ဆိုးဆိုးရွားရွားအသွင်ပြောင်းခြင်းတွင် ပါ၀င်သည့် အခြေခံဇီဝဖြစ်စဉ်တစ်ခုသည် ကြီးမားသော histocompatibility complex (MHC) မော်လီကျူးများမှ ကြားဝင်ဆောင်ရွက်ပေးသည့် antigen တင်ပြခြင်းဖြစ်ပါသည်။ခုတ်ထစ်ထားသော၊ အချိန်မတန်မီ ပိတ်ထားသော သို့မဟုတ် ခေါက်ထားသော ပရိုတိန်းများမှ ပလတ်စတစ်များ (8-12 အမိုင်နိုအက်ဆစ်ရှည်) ကို MHC-I heterodimer (β-2-microglobulin၊ β2M) ဟုခေါ်သော MHC-I လေးလံပြီး အပေါ့စားကွင်းဆက်များပါရှိသော MHC-I heterodimer ထဲသို့ ထည့်ပေးပါသည်။ရရှိလာသော တည်ငြိမ်သော MHC-I ညှပ်များကို ဆဲလ်မျက်နှာပြင်သို့ ပို့ဆောင်ကာ ၎င်းတို့သည် ဆဲလ်မျက်နှာပြင်တွင် CD8+ T ဆဲလ်များ (cytotoxic T cells) 17 သို့ သယ်ဆောင်သွားသည်။T ဆဲလ်များသည် အကျိတ်-သတ်သတ်မှတ်မှတ် အန်တီဂျင်ကို သယ်ဆောင်သည့် ဤရောဂါပိုးများနှင့် ဆဲလ်များကို မှတ်မိပြီး ဖျက်ဆီးသည်။ထို့ကြောင့်၊ ရောဂါပိုးများနှင့် အကျိတ်ဆဲလ်များသည် ခုခံအားစောင့်ကြည့်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် antigen တင်ပြခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို မကြာခဏ ဖိနှိပ်သည်။ထို့အပြင်၊ MHC-I သည် လူ့အကျိတ်များ၏ 40-90% တွင် ထိန်းညှိမှုကို လျှော့ချထားပြီး ပိုနည်းသော ခန့်မှန်းခြေ 19 နှင့် ဆက်စပ်နေပါသည်။
ရောဂါပိုးများကို တုံ့ပြန်ရာတွင် ပါဝင်သော မျိုးဗီဇများသည် အနားယူသည့် အခြေအနေနှင့် တက်ကြွသော စာသားမှတ်တမ်းများအကြား လျင်မြန်စွာ ပြောင်းလဲရမည်ဖြစ်သည်။ထို့ကြောင့်၊ များစွာသောဆယ်လူလာပရိုတိန်းများသည် အချိန်တိုအတွင်း မြင့်မားသော IFN လိုအပ်ချက်အတွက် တုံ့ပြန်မှုတွင် ပါဝင်သည်ဟု ယူဆချက်တွင်၊ မြှင့်တင်ခြင်းနှင့် chromatin 20,21 တို့ကို ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းအပါအဝင်၊လေ့လာမှုအများစုသည် IFN ၏ရှေ့မှောက်တွင် ISG ပရိုတင်းပါတနာတစ်ဦးချင်းစီကိုဖော်ထုတ်ခြင်းအပေါ်အာရုံစူးစိုက်ထားသည်။မော်ဒယ်ဆဲလ်စနစ်များရှိ proteomic နှင့် transcriptomic လေ့လာမှုအများအပြားသည် ဆယ်လူလာအခင်းအကျင်းအပေါ် IFN ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းဖော်ပြခဲ့သည်။သို့သော်လည်း၊ interferons မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော ဒိုင်းနမစ်များကို နားလည်မှု တိုးပွားလာသော်လည်း ISGs ၏ ပါဝင်ပတ်သက်မှုအကြောင်းကို ကျွန်ုပ်တို့ မသိသေးပါ။interferon အချက်ပြခြင်း၏ ရှုပ်ထွေးမှုနှင့် အချိန်-အမှီအခိုကင်းသော ဒိုင်းနမစ်များကို သုံးသပ်သောအခါတွင် မေးခွန်းနှစ်ခု ပေါ်လာသည်- (i) အမြန်အချက်ပြခြင်းတွင် ပါဝင်သည့် multiprotein ရှုပ်ထွေးမှုများကို တည်ငြိမ်အောင်ထိန်းထားနိုင်ပါသလား၊ (ii) အဆိုပါ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို 3D အာကာသအဖြစ် ပုံဖော်နိုင်ပါသလား။
ဤပြဿနာများကိုဖြေရှင်းရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် IFNα-induced ပရိုတိန်းအပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်နှင့် ၎င်း၏ဒိုင်းနမစ်များကိုလေ့လာရန်အတွက် ဒြပ်ထုရောင်စဉ် (CLMS) နှင့်တွဲဖက်ထားသော disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) ကို အကောင်အထည်ဖော်ခဲ့သည်။DSS သည် vivo ရှိ ပရိုတင်းအကြွင်းအကျန်များနှင့် ပရိုတင်းအကြွင်းအကျန်များကြား covalent နှောင်ကြိုးများကို ပေါင်းထည့်သည်။နောက်ဆက်တွဲ MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချက်သည် ဆက်စပ်ဆက်နွယ်မှုဟုခေါ်သော ပရိုတိန်းတစ်ခုအတွင်းရှိ သီးခြားနေရာဒေသများ၏ အနီးနားရှိ နေရာများကို ရောင်ပြန်ဟပ်သည့် ချိတ်ဆက်ထားသောလင့်ခ်များကို ဖော်ပြသည့် သီးခြားဆိုက်များကို ထုတ်ဖော်ပြသသည်။ဤချဉ်းကပ်နည်းကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်း-ပရိုတင်း ရှုပ်ထွေးမှုများအပြင် interferon-induced multiprotein အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်များကို ကျွန်ုပ်တို့ ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။အဆိုပါ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုအသစ်၏ အပိုင်းခွဲတစ်ခုကို ထပ်မံစမ်းသပ်ခြင်းဖြင့်၊ H2BFS (H2B histone-type FS; ၎င်းနောက် H2B ဟုရည်ညွှန်းသည်) နှင့် MDN1 တို့သည် HLA-A အတွက် binding လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များအဖြစ် လုပ်ဆောင်ကြောင်း ပြသပါသည်။
Flo-1 ဆဲလ်များသည် အစာမျိုပြွန်ကင်ဆာ၏ အဓိကအင်္ဂါရပ်များကို တုပသောကြောင့် အစာမျိုပြွန်ကင်ဆာ၏ vitro ပုံစံများတွင် လူသိများသော တစ်မျိုးဖြစ်သည်။သို့သော်၊ အကျိတ်အားလုံးသည် ကိုယ်ခံအားမဖြစ်စေဘဲ Flo-1 ဆဲလ်များသည် interferon ကုသမှုကို တုံ့ပြန်ခြင်းရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Flo-1 ဆဲလ်များကို 10 ng/ml IFNα ဖြင့် 72 နာရီကြာ ကုသပေးခဲ့သည်။Flo-1 ဆဲလ်များသည် ကုသမှုပြီးနောက် 2 နာရီအကြာတွင် စတင်ပြီး 72 နာရီကြာ ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ပြီးနောက် pSTAT1 နှင့် IRF1 ၏အစောပိုင်း induction ကိုပြသခဲ့သည်၊ IRF1 (ပုံ 1A) ၏ ငြိမ်ဝပ်မှုအဆင့်တွင် အချိန်-အပေါ်မူတည်၍ ကျဆင်းသွားပါသည်။ISGs (MX1၊ IFITM1၊ OAS1/2၊ နှင့် ISG15) သည် IFNα (ပုံ 1A) ကို တုပပြီး 6 နာရီအကြာတွင် ပြင်းထန်စွာ လှုံ့ဆော်ပေးသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။အတူတူ၊ ဤအချက်အလက်များသည် interferon တုံ့ပြန်မှုများကို လေ့လာရန် ဤဆယ်လူလာမော်ဒယ်ကို အသုံးပြုနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
IFNα ကုသမှုပြီးနောက် Flo-1 ဆဲလ်များတွင် ကွဲပြားသောပရိုတိန်းဖော်ပြချက် တုံ့ပြန်မှုများ။(က) 2၊ 6၊ 24၊ 48 နှင့် 72 နာရီများအတွက် 10 ng/ml IFNα ဖြင့် ကုသထားသော Flo-1 ဆဲလ်များတွင် ပရိုတင်းဓာတ်ဖော်ပြမှုကို ညွှန်ပြထားသော ISG ပဋိပစ္စည်းများကို အသုံးပြု၍ immunoblot မှ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။(ခ) ညွှန်ပြသည့်အချိန်နှင့် ပြင်းအားအတွက် DSS နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် ဆဲလ်တစ်ခုလုံး၏ ထုတ်ယူမှုများ၏ Coomassie အပြာရောင် SDS-PAGE ဂျယ်များ။(ဂ) တူညီသောနမူနာများမှ p53(DO-1) ပဋိပစ္စည်းဖြင့် စစ်ဆေးထားသော ကိုယ်စားလှယ် immunoblot သည် ပရိုတင်း အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ခြင်း၏ အတိုင်းအတာကို အကဲဖြတ်ရန်။
တွင်းရှိ ပရိုတိန်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု အခင်းအကျင်းကို ဖမ်းယူရန် ၎င်း၏ အမြှေးပါး စိမ့်ဝင်နိုင်မှု မြင့်မားပြီး တုံ့ပြန်မှု အချိန်တိုတောင်းသောကြောင့် ကျယ်ပြန့်စွာ အသုံးပြုသော အပြန်အလှန် ချိတ်ဆက်ခြင်း အေးဂျင့် DSS ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။တိုတောင်းသောတုံ့ပြန်မှုအချိန်သည် လင့်ခ်ချိတ်ထားသောပရိုတိန်းများ၏ အစုလိုက်အများအပြားဖွဲ့စည်းခြင်းကို ဟန့်တားပေးသည်၊ ထို့ကြောင့် crosslinker ၏တည်ငြိမ်မှုကိုထိန်းသိမ်းထားသည်။အကောင်းဆုံး DSS အာရုံစူးစိုက်မှုအား ဆုံးဖြတ်ရန်နှင့် over-crosslinking ကိုရှောင်ရှားရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆဲလ်များကို 5၊ 2.5၊ နှင့် 1 mM DSS ကို 5၊ 10၊ 5၊ နှင့် 30 မိနစ်တို့၌ အသီးသီးပြသခဲ့ပြီး Coomassie-stained SDS-PAGE မှ lysates ကို ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာပါသည်။ (ဒေတာမပြပါ။)ဆဲလ် lysates များသည် အနိမ့်ဆုံး အာရုံစူးစိုက်မှု နှင့် အတိုဆုံး အချိန်မှတ် တွင် လွန်စွာ အပြန်အလှန် ချိတ်ဆက်နေပုံပေါ်သည်။ထို့ကြောင့်၊ DSS ကို 5 မိနစ်အတွင်း 1၊ 0.5 နှင့် 0.1 mM သို့ တိုင်တန်းထားသည်။ (ပုံ 1B)။အကောင်းမွန်ဆုံးသော လင့်ခ်ချိတ်ခြင်းကို 5 မိနစ်ကြာ 0.5 mM DSS ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး IFNα ဖြင့် ကုသထားသော ဆဲလ်များအတွက် ဤအခြေအနေများကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ထို့အပြင် ပုံ 1C၊ ပရိုတိန်းဖြတ်ကျော်ချိတ်ဆက်ခြင်းအဆင့်ကို အကဲဖြတ်ရန် p53 (DO-1) ပဋိပစ္စည်းကို အသုံးပြုထားသည့် အနောက်တိုင်း blot တစ်ခုကို ပြသထားသည်။
Flo-1 ဆဲလ်များကို crosslinker မထည့်မီ 10 ng/ml IFNα ဖြင့် ကုသခဲ့သည်။အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသောဆဲလ်များကို နောက်ပိုင်းတွင် အဆင့်နှစ်ဆင့် ပရိုတီယိုခွဲထုတ်ခြင်းဖြင့် lyse လုပ်ခဲ့ပြီး ပရိုတင်းများကို FASP (ပုံ။ 2) 24,25 ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။Cross-linked tryptic peptides များကို အစုလိုက်အပြုံလိုက် spectrometry ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (ပုံ။ 2)။ထို့နောက် MS/MS ရောင်စဉ်ကို ပရိုတင်းအစီအစဥ်နှင့် ကိုက်ညီပြီး MaxQuant26,27 ဖြင့် တိုင်းတာသည်။Cross-linked peptides အား SIM-XL ပရိုဂရမ်ကို အသုံးပြု၍ ရရှိထားသော ရောင်စဉ်တန်းများမှ ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိခဲ့ပြီး တစ်ခုချင်းစီမှ ဒြပ်ပေါင်းများကို xQuest28 နှင့် SIM-XL29 ပွင့်လင်းရင်းမြစ် ကွန်ပြူတာဆော့ဖ်ဝဲလ်ပိုက်လိုင်းများကို အသုံးပြု၍ ရှုပ်ထွေးသောကွန်ရက်တစ်ခုသို့ ပေါင်းစပ်ထားသည်။SIM-XL သည် ပရိုတင်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု၊ အတွင်းကွင်းဆက်များနှင့် ရိုးရှင်းသော သို့မဟုတ် ရှုပ်ထွေးသော ပရိုတိန်းအရောအနှောများတွင် ကွင်းဆက်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ပြီး ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံများတွင် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို မြင်သာစေရန် script များကို ပေးပါသည်။ထို့အပြင်၊ ၎င်းသည် MS/MS29 ရောင်စဉ်အရည်အသွေးအရ ကူးယူကိုးကားမှုတစ်ခုစီကို ID ရမှတ်အဖြစ် အဆင့်သတ်မှတ်သည်။ယုံကြည်စိတ်ချရသော ပရိုတင်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများနှင့် ရှုပ်ထွေးမှုများ အများအပြားကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး၊ မော်လီကျူးဒိုင်းနမစ် (MD) မော်ဒယ်ကို အသုံးပြု၍ မော်လီကျူလာဒိုင်းနမစ် (MD) မော်ဒယ်လ်ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ် ခုခံအားကျဆင်းမှုနှင့် ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ အပြောင်းအလဲများကို အသုံးပြု၍ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအစုအသစ်တစ်ခုကို ထပ်မံလေ့လာခဲ့သည်။
CLMS နည်းလမ်း၏ ဇယားကွက် ခြုံငုံသုံးသပ်ချက်။Flo-1 ဆဲလ်များကို 10 ng/ml IFNα ဖြင့် 24 နာရီကြာ ကုသခဲ့ပြီး၊ ထို့နောက် DSS ကို အသုံးပြုကာ situ ပရိုတင်းကို အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် ဆဲလ် lysis နှင့် trypsinization ဖြင့် ကုသခဲ့သည်။ချိတ်ဆက်ထားသောနမူနာများကို Orbitrap mass spectrometer အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး LC-MS/MS ကာလအတွင်း peptide ရှေ့ပြေးနမူနာများကို အပိုင်းပိုင်းခွဲရန်အတွက် နောက်ထပ်နမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိပ်ဖြာထားသည်။Crosslinked Peptides (SIM-XL) ပရိုဂရမ်၏ Spectrum Recognition Machine ကို အသုံးပြု၍ ရရှိသော ရောင်စဉ်တန်းမှ ချိတ်ဆက်ထားသော peptides နှစ်ခုကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ဒြပ်ပေါင်းအားလုံးကို တွက်ချက်မှုဆိုင်ရာပိုက်လိုင်းများအသုံးပြု၍ ရှုပ်ထွေးသောကွန်ရက်တစ်ခုအဖြစ် ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။မှားယွင်းသော အပြုသဘောနှုန်း (FDR) ရမှတ်များအပေါ် အခြေခံ၍ ယုံကြည်မှုနည်းပါးသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို စစ်ထုတ်ပါ။အသစ်သော သစ္စာရှိမှုမြင့်မားသော ပရိုတင်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအသစ်အများအပြားကို ပူးတွဲကိုယ်ခံအားကျစေခြင်းကို အသုံးပြု၍ ထပ်မံအတည်ပြုခဲ့ပြီး၊ ရှုပ်ထွေးသောပုံစံပြောင်းလဲမှုများကို မော်လီကျူလာဒိုင်းနမစ် (MD) မော်ဒယ်လ်ဖြင့် ဆန်းစစ်ခဲ့သည်။
စုစုပေါင်း ~30,500 နှင့် ~28,500 peptides များကို MaxQuant အား မနှိုးဆွဘဲ လှုံ့ဆော်ထားသော IFNα နမူနာများတွင် အသီးသီး တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲဇယား S1၊ ပုံ 3A)။ဖြစ်ရပ်နှစ်ခုစလုံးတွင် peptide အရှည်ဖြန့်ဖြူးမှုသည် ပိုကြီးသော peptides များ၏ အချိုးအစားကို ပြသခဲ့ပြီး အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသော peptides (ပုံ 3B,C) ပါဝင်မှုကို ညွှန်ပြသည်။ထို့အပြင်၊ IFNα ကုသသောနမူနာများ (ပုံ။ 3C) တွင် 40-55 အကွာအဝေးတွင် ပိုကြီးသော peptides များ၏ အချိုးအစား ကြီးမားပါသည်။log2 ပြင်းထန်မှုကို ဆန့်ကျင်သည့် ပရိုတိန်းမြေပုံဆွဲခြင်းတွင် ဂန္ထဝင် interferon-လှုံ့ဆော်သော ပရိုတိန်းများသည် MX1၊ IFIT1/3၊ OAS2/3၊ DDX58၊ နှင့် HLA-F (ပုံ 3D) အပါအဝင် မကုသရသေးသော နမူနာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အပေါများဆုံးဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။Reactome လမ်းကြောင်းဒေတာဘေ့စ်ကို အသုံးပြု၍ IFNα ကုသမှုအတွက် တုံ့ပြန်မှုတွင် သုံးဆပိုမိုကြွယ်ဝသော ပရိုတိန်းများအတွက် လမ်းကြောင်းများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းမှ MHC-I-mediated antigen တင်ပြခြင်းနှင့် လုပ်ဆောင်ခြင်းသည် အထင်ရှားဆုံးလမ်းကြောင်းဖြစ်သည် (ပုံ 3E) ကိုပြသခဲ့သည်။အစောပိုင်းအစီရင်ခံစာများနှင့်အညီ OAS နှင့် ISG15 မှဖျန်ဖြေပေးထားသော ဗိုင်းရပ်စ်ဆိုင်ရာတုံ့ပြန်မှုများအပြင် IFNα/β နှင့် cytokine အချက်ပြခြင်းတို့သည် လမ်းကြောင်းများကြားတွင် စတင်အသုံးပြုနိုင်ပြီဖြစ်သည်။ထို့အပြင်၊ SIM-XL ကိုအသုံးပြုထားသော မူလရရှိထားသော MS/MS spectra မှ lysine- နှင့် serine- သီးခြားပရိုတိန်းဖြတ်ကျော်-လင့်ခ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုက ဆဲလ်အမျိုးအစား 5 တွင် ဆဲလ်အမျိုးအစား 9 တွင် တစ်ဦးချင်းစီ ISG လွန်ကဲစွာဖော်ပြခြင်းဆိုင်ရာလေ့လာမှုများကို meta-analysis ဖြင့် ဗိုင်းရပ်စ်အမျိုးအစား 9 ခုမှ ဗိုင်းရပ်စ် 20 ကို ဖြန့်ကျက်ထားသော ISGs 104 ခုကို ဖော်ပြခဲ့သည်။သို့သော်၊ ကြီးမားသောဒေတာအတွဲများကိုစစ်ဆေးခြင်း၏တွက်ချက်မှုဆိုင်ရာကန့်သတ်ချက်များကိုကျော်လွှားရန်၊ Padaria et al မှတင်ပြသော IRDS ဗီဇများစာရင်းအကြားဖြစ်နိုင်ချေရှိသောအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကိုရှာဖွေရန် Padaria et al., အများစုမှာ ISGs များဖြစ်ကြသည်
IFNα (MaxQuant မှရရှိသောဒေတာ) ကို တုံ့ပြန်ရာတွင် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသော ပရိုတင်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း။(က) IFNα14 ကုသပြီး မကုသရသေးသော Flo-1 နမူနာများတွင် ဖော်ပြထားသော ဘုံနှင့်သီးသန့် peptides အရေအတွက်ကို ကိုယ်စားပြုသည့် Venn ပုံကြမ်း။မကုသရသေးသော (B) နှင့် IFNα ကုသထားသော (C) အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသော နမူနာများ၏ Peptide အရှည် ဖြန့်ဖြူးခြင်း။(ဃ) မကုသရသေးသော နှင့် IFNα14 ကုသထားသော Flo-1 ဆဲလ်များကြား log2 (LFQ ပြင်းထန်မှု) ကို ကိုယ်စားပြုသည့် အပူမြေပုံ။ဘယ်ဘက်အကန့်သည် IFNα ၏ရှေ့မှောက်တွင် အတက်ကြွဆုံးလုပ်ဆောင်နေသော ပရိုတင်းများကိုပြသသည်။(င) IFNα ကုသမှုပြီးနောက် အဓိက ကြွယ်ဝသော လမ်းကြောင်း 20 ကို ကိုယ်စားပြုသည့် Histogram။Reactome လမ်းကြောင်းဒေတာဘေ့စ်သည် ထိန်းညှိထားသော IFNα-တုံ့ပြန်မှုပရိုတိန်းများတွင် လေးဆပြောင်းလဲမှုများထက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသည်။
Interferon-mediated ISG လှုံ့ဆော်မှုအား ကောင်းစွာမှတ်တမ်းတင်ထားသော်လည်း မော်လီကျူးအဆင့်တွင် ဤပရိုတိန်းများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်မှုများစွာတွင် မည်သို့အဆုံးစွန်သွားသည်ကို နားမလည်နိုင်ပါ။ကျွန်ုပ်တို့သည် သိရှိထားသော ISGs များကြားတွင် ယုံကြည်မှုမြင့်မားစွာဖြင့် ပရိုတင်းဓာတ် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို စုံစမ်းခဲ့ပါသည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက IFNα ကုသမှုကိုတုံ့ပြန်တဲ့အနေနဲ့ ကြီးမားတဲ့ရှုပ်ထွေးမှုဖြစ်စေတဲ့ MX1၊ USP18၊ ROBO1၊ OAS3 နဲ့ STAT1 ပရိုတင်းများအပါအဝင် ကွန်ရက်တစ်ခုကို ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။အရေးအကြီးဆုံးမှာ၊ ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို IFNα နှင့် ကုသထားသော triplicates များအားလုံးတွင် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး IFNα ကုသမှုကို တုံ့ပြန်ရန်အတွက် ၎င်းတို့ကို သီးသန့်ဖွဲ့စည်းထားသည်ဟု ယူဆကာ ကုသမထားသောနမူနာများတွင် မတွေ့ခဲ့ရပါ။STAT1 သည် ဤ ISGs များ၏ ဖော်ပြချက်ကို ထိန်းညှိပေးကြောင်း သိရှိထားသော်လည်း ပရိုတင်းအဆင့်ရှိ ISG များနှင့် ၎င်း၏ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို မလေ့လာရသေးပါ။STAT1 ၏ ပုံဆောင်ခဲဖွဲ့စည်းပုံသည် ၎င်း၏ helical domain (CCD) သည် dimers35 ၏ဖွဲ့စည်းစဉ်အတွင်း DNA သို့မဟုတ် protomers များနှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုတွင် ပါဝင်ခြင်းမရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ဤ α-helices များသည် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများဖြစ်ပေါ်ရန်အတွက် 35 ရေအားလျှပ်စစ်မျက်နှာပြင်ဧရိယာကို ပံ့ပိုးပေးသည့် helical helix တည်ဆောက်ပုံဖြစ်သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ CLMS ဒေတာတွင်၊ STAT1 နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအများစုသည် CCD မတိုင်မီ၊ ချိတ်ဆက်သူဒိုမိန်း သို့မဟုတ် C-terminal အမြီး (အကြွင်းအကျန် 700-708) (ပုံ 4A) မတိုင်မီ SH2 ဒိုမိန်းတွင် ဖြစ်ပွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ယခင်လေ့လာမှုတစ်ခုအရ USP18 သည် STAT2 ၏ CCD နှင့် DNA-binding domain (DBD) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး type I interferon အချက်ပြမှု 24 ၏အတားအဆီးကို ပြေလည်စေရန် အမျိုးအစား I interferon receptor IFNAR2 ၏ subunit သို့ စုဆောင်းထားသည်။USP18 catalytic domain သည် STAT1 DBD (ပုံ 4A,D) နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိကြောင်း STAT1 နှင့် STAT2 နှစ်ခုစလုံးက USP18 သို့ IFNAR2 သို့ ဆွဲဆောင်ရာတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှ ပါဝင်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များကိုလည်း ပြသခဲ့သည်။
IFNα ဖြင့် ကုသထားသော ချိတ်ဆက်ထားသော ဆဲလ်များ တွင် သတ်မှတ်ထားသော ပရိုတင်း-ပရိုတင်း ISG ကွန်ရက်။(က) ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ပြသသည့် 2D အပြန်အလှန် ကွက်ကွက် (SIM-XL ပရိုဂရမ်တွင် ထုတ်ပေးသည်)၊ စပ်ကြားမော်လီကျူး အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ကိုယ်စားပြုသည့် မျဉ်းကြောင်းများ (crosslink cutoff 3.5 ဟု သတ်မှတ်ထားသည်)။မတူညီသော အထောက်အထားများ၏ ဒိုမိန်းများကို ၎င်းတို့၏ color32- MX1 ဒိုမိန်း၊ Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) နှင့် GED (569–660) တို့ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည်။OAS3 ဒိုမိန်းများ- OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), နှင့် OAS1_C (903-108)။Domain ROBO1၊ Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) နှင့် fn3 (777–864)။STAT1 အကွက်များ- STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), နှင့် STAT1_TAZ2bind (715–739)။(ခ) အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသော ပရိုတိန်းများ (MX1၊ UBP18၊ OAS3၊ ROBO1 နှင့် STAT1) အသီးသီးရှိ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများနှင့် အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများကို အပြာရောင်နှင့် အနီရောင်ဖြင့် အသီးသီးကြည့်ရှုပါ။လင့်ခ်ဖြတ်ကျော်မှုအဆင့်ကို 3.5 တွင် သတ်မှတ်ထားသည်။အစက်ကွက်များသည် MX1 (C)၊ USP18 (D)၊ ROBO1 (E) နှင့် OAS3 (F) နှင့် STAT1 အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုဆိုက်များကို ညွှန်ပြသည်ပုံတွင်၊ cross-link ရမှတ်အဆင့်ကို 3.0 ဟု သတ်မှတ်ထားသည်။(ဆ) PyMol (PyMOL မော်လီကျူးဂရပ်ဖစ်စနစ်၊ ဗားရှင်း 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) နှင့် OAS3 (pdb id: 4s3n34)။) အစီအစဉ်။
USP18 ၏ isoform နှစ်ခုကို လူသားများတွင် ဖော်ပြထားပြီး၊ နျူကလိယတွင် အများစုတည်ရှိသော ကိုယ်လုံးပေါ်ရှိ ပရိုတင်းတစ်မျိုးနှင့် N-terminal domain, USP18-sf မပါသော isoform ကို cytoplasm နှင့် nucleus 36 တို့တွင် အညီအမျှခွဲဝေပေးပါသည်။ထို့အပြင် N-terminus သည် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံမရှိဟု ခန့်မှန်းထားပြီး isopeptidase လုပ်ဆောင်ချက် သို့မဟုတ် ISG1537 binding မလိုအပ်ပါ။ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင်ဖော်ပြထားသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအများစုသည် ပရိုတင်း၏ N-terminus တွင်တည်ရှိပြီး အဆိုပါအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများတွင် USP18 (ပုံ 4A၊D) သည် အစအဆုံးပါဝင်ပြီး နျူကလိယတွင်ဖြစ်ပေါ်နိုင်ဖွယ်ရှိသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ အချက်အလက်များသည် N-terminus သည် ပရိုတင်းမှ ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုအတွက် အထူးပြုထားကြောင်းလည်း ဖော်ပြပါသည်။IFNAR2 binding site သည် အကြွင်းအကျန် 312-368 အကြားတွင် တည်ရှိပြီး မှတ်သားဖွယ်ရာမှာ၊ ရှုပ်ထွေးသော ပရိုတင်းများကို ဤဒေသနှင့် ဆက်စပ်မှု မရှိပါ (ပုံ 4A) 37,38 .ဤအချက်အလက်များကို စုစည်းထားသော IFNAR2 binding domain ကို receptor protein မှ သီးသန့်အသုံးပြုကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။ထို့အပြင်၊ OAS3 နှင့် ROBO1 သာလျှင် N-terminus နှင့် IFNAR2 binding site (ပုံ 4A) ၏ အထက်ပိုင်းဒိုမိန်းများနှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။
ROBO1 သည် transmembrane အချက်ပြခြင်းမော်လီကျူးများ၏ superfamily မှ immunoglobulin (Ig) နှင့် သက်ဆိုင်ပြီး extracellular ဒေသရှိ fibronectin (Fn) ဒိုမိန်းငါးခု ပါဝင်ပါသည်။ဤ extracellular domains များကို အမြှေးပါး-proximal ဒေသနှင့် single transmembrane helix 39 ဖြင့် လိုက်နာထားပါသည်။ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံမထားသော အတွင်းဆဲလ်တစ်ခုသည် C-terminus တွင် တည်ရှိပြီး effector protein binding39 ကို ပြေလည်အောင်ထိန်းညှိပေးသည့် ထိန်းသိမ်းထားသော sequence motifs ပါရှိပါသည်။အမိုင်နိုအက်ဆစ် ~ 1100 မှ 1600 အထိ ကျယ်ပြန့်သော ဒေသသည် အများအားဖြင့် မူမမှန်ပါ။MX1 သည် Ig, Fn, နှင့် အတွင်းပိုင်း ဆဲလ်လူလာ ဒိုမိန်းများ မှတဆင့် ROBO1 နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိပြီး STAT1 နှင့် အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှု အများစုသည် ၎င်း၏ CCD၊ လင့်ခ်လုပ်သော ဒိုမိန်း နှင့် ROBO1 ၏ C-terminus (ပုံ. 4A,E) အကြားတွင် ဖြစ်ပွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ DI၊ DIII၊ နှင့် OAS3 ချိတ်ဆက်ပေးသည့်နေရာများနှင့် အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများကို ROBO1 ပရိုတင်း (ပုံ 4A) တစ်လျှောက် ဖြန့်ဝေခဲ့သည်။
oligoadenylate synthase (OAS) ပရိုတိန်းမိသားစုသည် အတွင်းဆဲလ်နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော RNA (dsRNA) ကို လက်ခံပြီး ချည်နှောင်ကာ၊ ပုံစံတူပြောင်းလဲမှုများကို ခံယူကာ 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 .OASs သုံးခုတွင် OAS3 သည် dsRNA အတွက် အမြင့်မားဆုံးရင်းနှီးမှုကိုပြသပြီး RNase L ကိုအသက်သွင်းနိုင်ပြီး 2-5 As အနည်းဆုံးပမာဏကို ပေါင်းစပ်ကာ ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်း 41 ကိုကန့်သတ်ထားသည်ကိုတွေ့ရှိခဲ့သည်။OAS မိသားစုတွင် Polymerase ဘီတာ (pol-β) ကဲ့သို့သော နျူကလီးအိုတဒ် လွှဲပြောင်းပေးသည့် ဒိုမိန်းများ ပါဝင်သည်။ယခင်သုတေသနပြုချက်များအရ C-terminal domain (DIII) သည် OAS342 ကိုအသက်သွင်းရန်အတွက် လိုအပ်သော dsRNA-binding domain (DI) ပေါ်တွင်မူတည်ကြောင်း ပြသထားသည်။OAS3 ၏ DI နှင့် DII ဒိုမိန်းများသည် CCD နှင့် SH2 နှင့် STAT1 TAD (ပုံ 4A၊ F) အကြား လမ်းဆုံဒေသငယ်တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံပေါ်ရှိ မတူညီသောလင့်ခ်ချိတ်ထားသောဆိုဒ်များကို ထပ်ဆင့်တင်ခြင်းသည် β-sheet နှင့် DBD STAT1 ကွင်းဆက်နှင့် OAS3 ၏ DI ဒိုမိန်းအတွင်းရှိ အကြွင်းအကျန် 60–75 ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော အပွင့်အိတ်ကပ် သို့မဟုတ် အပေါက်တစ်ခုကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ထင်ရှားစေသည်။ရှုပ်ထွေးသော ပရိုတင်းများ၏ တိမ်းညွှတ်မှုသည် OAS3 နှင့် ၎င်း၏ DI ဒိုမိန်း၏ DNA-binding စွမ်းရည်ကို အနှောင့်အယှက်မဖြစ်စေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ထို့အပြင်၊ GTPase MX1 ၏ N-terminal ဒိုမိန်းသည် OAS3 ၏ DI နှင့် DIII ဒိုမိန်းများနှင့် ကျယ်ပြန့်စွာ အပြန်အလှန်သက်ရောက်မှုရှိသည်။OAS1 နှင့် MX1 ဒိုမိန်းသုံးခုလုံး (ပုံ S2A,B) နှင့် OAS1 ဒိုမိန်းတစ်ခုတည်း (ဓာတ်သတ္တုဖြင့်လည်း တက်ကြွစွာ) တုံ့ပြန်သည့် IFNα ကုသသော ထပ်ခါတလဲလဲသုံးကြိမ်စလုံးတွင် OAS1 နှင့် MX1 အကြား အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။
MX ပရိုတိန်းများသည် GTPase အဖြစ်လုပ်ဆောင်သော N-terminal GTPase ဒိုမိန်းပါဝင်သည့် dynein-like GTPases ၏ကြီးမားသောမိသားစု၏တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်သော GTP၊ ကိုယ်တိုင်စုဝေးမှုကို ပြေလည်အောင်ဆောင်ရွက်ပေးသည့် အလယ်အလတ်ဒိုမိန်းနှင့် GTPase (LZ) အဖြစ်လုပ်ဆောင်သော C-terminal leucine ဇစ် )domain effector domain25,43။MX1 သည် ဗိုင်းရပ်စ် gene43 ၏ ကူးယူဖော်ပြမှုကို ပိတ်ဆို့ရန် ဗိုင်းရပ်စ်ပိုလီမာရတ်၏ အခွဲများနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ယခင်က အစီရင်ခံထားသော တဆေးနှစ်ခု-ပေါင်းစပ်ဖန်သားပြင်တစ်ခုတွင် PIAS1-ဆက်စပ်သော MX1 သည် DNA-binding လုပ်ဆောင်ချက်ကို ပိတ်ဆို့ခြင်းဖြင့် STAT1-mediated gene activation ကို ဟန့်တားပြီး SUMO E344,45 ligase လုပ်ဆောင်ချက်လည်း ပါရှိသည်။ဤတွင်၊ MX1 သည် STAT1 (ပုံ 4C,D) နှင့် ချိတ်ဆက်ကြောင်း သက်သေပြနိုင်သော်လည်း၊ ဤတုံ့ပြန်မှုသည် IFNα တုံ့ပြန်မှုအတွက် STAT1-ဖျန်ဖြေထားသော gene activation ကိုမည်သို့အကျိုးသက်ရောက်ကြောင်း သရုပ်ပြပါသည်။ထို့အပြင်၊ MX1 သည် IFNα ကုသသော ထပ်ခါတလဲလဲ သုံးကြိမ်စလုံးတွင် IFIT3 နှင့် DDX60 တို့နှင့် ဓါတ်ပြုနေသည်ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိပါသည်။
DDX60 သည် IFN-induced cytoplasmic ရဟတ်ယာဉ်ဖြစ်ပြီး RIG-I-လွတ်လပ်သော RNA46 ဗိုင်းရပ်စ်ပိုး၏ ဆုတ်ယုတ်ပျက်စီးခြင်းတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှ ပါဝင်သည်ဟု ယခင်က အစီရင်ခံခံခဲ့ရသော IFN အမျိုးအစားဖြစ်သည်။၎င်းသည် RIG-I နှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်ပြီး ၎င်း၏အချက်ပြခြင်းကို လစ်ဂန်-သတ်သတ်မှတ်မှတ်ပုံစံဖြင့် 46. DDX60 တွင် DEXD/H-Box helicase ဒိုမိန်းနှင့် ဗိုင်းရပ်စ် RNA နှင့် DNA47 တို့ကို ချိတ်ဆက်ထားသည့် C-terminal helicase ဒိုမိန်းတစ်ခု ပါဝင်ပါသည်။MX1 နှင့် IFIT3 နှင့် ၎င်း၏အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအများစုသည် canonical domains သို့မဟုတ် motifs များမပါဘဲ ရှည်လျားသော N- နှင့် C-terminal ဒေသများတွင် ဖြစ်ပေါ်သည် (ပုံ။ S2E,F)။သို့သော်လည်း MX1 သည် DEXD/H-Box helicase ဒိုမိန်း (ပုံ. S2E) နှင့်လည်း ဆက်စပ်နေသည်။IFIT မိသားစု၏ ပရိုတင်းများတွင် tetrapeptide repeat (TPR) ဟုခေါ်သော ထူးခြားသော helix-turn-helix motif ၏ ကော်ပီများရှိသည်။IFIT3 သည် RIG-I အချက်ပြခြင်း၏ အပြုသဘောဆောင်သော မော်ဂျူလတာအဖြစ် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ထို့ကြောင့် MAVS ရှုပ်ထွေးမှု၏ အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များအရ IFIT3 နှင့် DDX60 တို့သည် IFIT3 ၏ TPR 3–6 ကြားတွင် အဓိကအားဖြင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်ကြပြီး RIG-I/MAVS အချက်ပြခြင်းတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှ ပါဝင်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုအပ်ပါသည်။
proteome တစ်ခုလုံးကို စိစစ်ခြင်းသည် တွက်ချက်မှုအရ ပြင်းထန်သောကြောင့်၊ ထို့နောက် IFNα ကုသသော ထပ်ခါတလဲလဲများထဲမှ တစ်ခုရှိနေခြင်းအတွက် လူ့ UniProt ဒေတာဘေ့စ်တစ်ခုလုံးကို စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ဤပုံတူတွင်၊ HLA-A အတွက် အလွန်ယုံကြည်စိတ်ချရသော အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်များစွာကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။MS/MS spectra မှသတ်မှတ်ထားသော ပရိုတင်းလမ်းကြောင်းများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် MHC-I-based antigen processing and presentation is induced the main pathway (ပုံ. 3D) ကိုပြသခဲ့သည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MHC-I မော်လီကျူးများ၏ ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုကို လေ့လာခြင်းတွင် ချိတ်ဆက်ထားသော နမူနာများအားလုံးကို ယုံကြည်စိတ်ချမှု မြင့်မားသော ဒီဂရီဖြင့် လေ့လာရန် အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။HLA တွင် α1၊ α2 နှင့် α3 ဒိုမိန်းများနှင့် အလင်းကွင်းဆက်များ ပါ၀င်ပြီး microglobulin β2 (β2m) သည် စဉ်ဆက်မပြတ် chaperone ပရိုတင်း 49 ဖြစ်သည်။endoplasmic reticulum တွင် စုစည်းပြီးသည်နှင့်၊ HLA သည် peptide ligands 50 မရှိခြင်းကြောင့် မတည်မြဲပါ။peptide-binding groove ကို peptide မဟုတ်သောပုံစံတွင် မြင့်မားသော polymorphic နှင့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံမရှိသော α1 နှင့် α2 domains များနှင့် အတော်လေးနည်းသော polymorphic α351 domain တို့ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည်။IFNα ၏ရှေ့မှောက်တွင်၊ HLA-A ရှုပ်ထွေးမှုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်- တစ်ခုသည် HMGA1 နှင့် H2B (ပုံ 5၊ Table S3) နှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်ပြီး အခြားတစ်ခုသည် MDN1၊ LRCH4 နှင့် H2B (ပုံ 6) နှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်သည်။
IFNα သည် H2B (H2BFS) နှင့် HMGA1 ဖြင့် HLA-A အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်ကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။(က) H2B-HLA-A-HMGA1 complex ရှိ မတူညီသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို သရုပ်ဖော်သည့် 2D ကွက် (SIM-XL ဆော့ဖ်ဝဲ) − interlink (အပြာ)၊ interlink (အနီရောင်) နှင့် single link (အနက်ရောင်)။.မတူညီသော အထောက်အထားများ၏ ဒိုမိန်းများသည် အရောင်ကုဒ်နံပါတ် 32- H2B (histone; 2–102) နှင့် MHC-I (MHC_1; 25–203၊ အုပ်စု C1; 210–290 နှင့် MHC_I_C; 337–364)။လင့်ခ်ဖြတ်ကျော်မှုအဆင့်ကို 3.5 တွင် သတ်မှတ်ထားသည်။အစက်ချကွက်များသည် H2B (B) နှင့် HMGA1 (C) နှင့် HLA-A အပြန်အလှန်ဆက်ဆံရေးဆိုက်များကို ညွှန်ပြပြီး peptides နှစ်ခုကြားရှိ K သို့မဟုတ် S အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုဆိုက်များကို ညွှန်ပြသည်။ပုံတွင်၊ cross-link ရမှတ်အဆင့်ကို 3.0 ဟု သတ်မှတ်ထားသည်။(ဃ) PyMOL ပရိုဂရမ်ရှိ H2B၊ HLA-A နှင့် HMGA1 ပရိုတိန်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံများတွင် ပြသထားသော ပရိုတင်းများကြား ဆက်ဆံရေး။ဤဖွဲ့စည်းပုံများကို Phyre2 ဆာဗာ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ကို အသုံးပြု၍ ပုံစံထုတ်ထားပြီး H2B၊ HLA-A နှင့် HMGA1 ပရိုတိန်းများအတွက် 1kx552၊ 1kj349 နှင့် 2eze55 အသီးသီး ရှိသည်။
IFNα သည် H2B (H2BFS), MDN1 နှင့် LRCH4 နှင့် HLA-A အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်ကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။(က) စက်ဝိုင်းတစ်ခုအဖြစ် MDN1 ကိုယ်စားပြုထားသော 2D အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်သောမြေပုံ (SIM-XL ဆော့ဖ်ဝဲလ်တွင်ထုတ်လုပ်ထားသည်) တွင်ပြသထားသည့် ရင်ကြားခံမော်လီကျူး (အနီရောင်) နှင့် စပ်ကြားမော်လီကျူး (အပြာ) လင့်ခ်များ။လင့်ခ်ဖြတ်ကျော်မှုအဆင့်ကို 3.5 တွင် သတ်မှတ်ထားသည်။မတူညီသော အထောက်အထားများ၏ ဒိုမိန်းများသည် အရောင်ကုဒ်နံပါတ် 32- H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203၊ အုပ်စု C1; 210–290 နှင့် MHC_I_C; 337–364) နှင့် LRCH4 (LRR_8 (68–126))၊ LRR_8 (137–194) နှင့် CH (535–641))။(ခ) PyMOL ပရိုဂရမ်ရှိ H2B၊ HLA-A၊ LRCH4 နှင့် MDN1 ပရိုတင်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံများတွင် ပြသထားသော ပရိုတင်းများကြား ဆက်စပ်မှုများ။ဤဖွဲ့စည်းပုံများအား Phyre2 ဆာဗာ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ကို အသုံးပြု၍ ပုံစံပလိတ်တည်ဆောက်ပုံများ 1kx552၊ 1kj349၊ 6hlu62 နှင့် 6i2665 H2B၊ HLA-A၊ LRCH4 နှင့် MDN1 ပရိုတင်းများ၊ အသီးသီး။HLA-A အတွက် H2B (C)၊ LRCH4 (D) နှင့် MDN1 (E) ဖြင့် HLA-A အတွက် K သို့မဟုတ် S အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုဆိုက်များကို ပြသသည့် အစက်ကွက်များ။ကွက်များအတွက်၊ လင့်ခ်ပေါင်းကူးရမှတ်အဆင့်ကို 3.0 သို့ သတ်မှတ်ထားသည်။
ဂျီနိုမ်၏ ခိုင်မာမှုကို ထိန်းသိမ်းထားသည့်အပြင်၊ histone H2B သည် စာသားမှတ်တမ်း၏ စည်းမျဉ်းတွင်လည်း ပါဝင်ပါသည်။H2B ပရိုတင်းတွင် ကွင်းများနှင့် C-terminal အမြီး 41,52 တို့ဖြင့် ခွဲထားသော α-helices သုံးခုဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော ဗဟို histone domain (HFD) ပါဝင်သည်။H2B နှင့်အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအများစုသည် HFD heterodimer (ပုံ. 5A,B) ဖြင့် trimerization ပေးသော α1 helix တွင်ဖြစ်ပေါ်သည်။lysins သည် DNA binding တွင်ပါ၀င်သော်လည်း၊ အချို့သော lysins များသည် အခြားရွေးချယ်စရာ acetylation သို့မဟုတ် methylation sites များဖြစ်သည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ H2B မှ K43၊ K46၊ နှင့် K57 အကြွင်းအကျန်များသည် တိုက်ရိုက် DNA ချိတ်တွယ်ခြင်းတွင် မပါဝင်သော်လည်း အမျိုးမျိုးသော ကူးယူဖော်ပြမှုနောက်ပိုင်း ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများ၏ ပစ်မှတ်များဖြစ်သည်။အလားတူ၊ H2B ရှိ အကြွင်းအကျန် K44၊ K47 နှင့် K57 သည် အခြားပရိုတိန်းများနှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများအပါအဝင် IFNα ၏ရှေ့မှောက်တွင် အခြားအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်နေနိုင်သည်။ထို့အပြင်၊ extrachromosomal histone H2B သည် ဆဲလ်အမျိုးအစားအမျိုးမျိုးတွင် ခုခံအားတုံ့ပြန်မှုကို အသက်သွင်းပေးသည်၊၊ ကူးစက်နိုင်သောအေးဂျင့်များ သို့မဟုတ် ပျက်စီးနေသောဆဲလ်များမှရရှိသော နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA (dsDNA) အပိုင်းအစများကို သိရှိရန် cytosolic အာရုံခံကိရိယာအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။DNA ဗိုင်းရပ်စ်များရှိနေချိန်တွင် H2B လျော့နည်းခြင်းသည် IFN-β ထုတ်လုပ်မှုနှင့် STAT154 phosphorylation ကို ဟန့်တားစေသည်။H2B သည် အခြားသော core histones 54 ထက် နျူကလိယအတွင်း လျင်မြန်စွာ ရွေ့လျားနိုင်သည်ကိုလည်း သိရှိသည်။MDN1 နှင့် LRCH4 နှင့် H2B အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ရွေးချယ်ထားသော မကုသရသေးသောနမူနာများတွင်လည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။HLA-A သည် IFNα ကုသသည့်နမူနာသုံးခုလုံးတွင် H2B နှင့် ဓါတ်ပြုမှုများနှင့် မကုသရသေးသော ထပ်ခါထပ်ခါနမူနာတစ်ခုတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤဒေတာများသည် စာသားပြောင်းခြင်းဆိုင်ရာ စည်းမျဥ်းစည်းကမ်းမှ ကင်းလွတ်သော အစားထိုးဇီဝကမ္မလုပ်ဆောင်မှုတွင် H2B ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ထင်ဟပ်စေသည်။
HMGA1 (မြင့်မားသောရွေ့လျားနိုင်မှုအုပ်စု AT-Hook 1)၊ သေးငယ်သောနျူကလီယိုပရိုတိန်းဓာတ်များကြွယ်ဝသောရောဂါကိုမြှင့်တင်သောအမိုင်နိုအက်ဆစ်ကို HLA-A နှင့်ဆက်စပ်မှုဖြင့်ဖော်ထုတ်ထားသည်။၎င်းတွင် အက်စစ်ဓာတ် C-terminal အမြီးနှင့် AT ချိတ်ဟုခေါ်သော ကွဲပြားသော DBD သုံးခုပါရှိသည်ဤချည်နှောင်မှုသည် DNA ကို ကွေးရန် သို့မဟုတ် ဖြောင့်သွားစေပြီး ၎င်း၏သဘောဆန္ဒအစီအစဥ်ကို ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုရန် canonical စာသားမှတ်တမ်းအချက်များအား ခွင့်ပြုပေးသည်။C-terminal အမြီးသည် ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများနှင့် ကူးယူခြင်းဆိုင်ရာအချက်များ စုဆောင်းခြင်းတွင် ပါဝင်သည်ဟု ယူဆရပြီး၊ C-terminal ဖျက်ခြင်းမျိုးပြောင်းများသည် transcription57 မစတင်နိုင်သောကြောင့် ဖြစ်သည်။ထို့အပြင်၊ ဤဒိုမိန်းတွင် kinases 58 အတွက် လူသိများသော အလွှာများဖြစ်သည့် ထိန်းသိမ်းထားသော phosphorylation site အများအပြားပါရှိသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် C-terminal ဒိုမိန်းအပြင်ဘက်ရှိ HMGA1 နှင့် HLA-A နှင့် H2B အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို စောင့်ကြည့်လေ့လာခဲ့ပြီး C-terminal ဒိုမိန်းအား စာသားကူးယူဖော်ပြခြင်းအတွက် အဓိကအသုံးပြုသည် (ပုံ။ 5A၊ C)။HMGA ပရိုတိန်းများသည် အဒက်တာ DNA နှင့် ချိတ်ဆက်ရန်အတွက် histone H1 နှင့် ယှဉ်ပြိုင်နိုင်ပြီး အသုံးပြုနိုင်မှု 57 ကို တိုးမြင့်စေသည်။အလားတူပင်၊ HMGA သည် histone H1 နှင့် ပြိုင်ဆိုင်ရာတွင် linker DNA တစ်လျှောက်ရှိ histone H2B နှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိပုံရသည်။HMGB1 သည် HLA-A၊ -B နှင့် -C တို့ကို dendritic ဆဲလ်များတွင် လှုံ့ဆော်ပေးကာ ၎င်းတို့၏ activation59 သို့ ဦးတည်စေသည်၊ သို့သော် HMG နှင့် HLA အကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ယခင်က အစီရင်ခံခြင်းမရှိပါ။HMGA1 သည် HLA-A ၏ α1 နှင့် α3 ဒိုမိန်းများနှင့် ဓါတ်ပြုမှုများဖြစ်ပြီး ၎င်း၏ 3 DBD (ပုံ 5A၊C) ပြင်ပတွင် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအများစုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏လက်ထဲတွင် HLA-A ကို နူကလိယတွင် နေရာချထားကြောင်း တွေ့ရှိရပြီး H2B နှင့် HMGA1 တို့သည် နျူကလိယတွင် ရှိနေသောကြောင့်၊ ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် နျူကလိယတွင် ဖြစ်ပေါ်နိုင်ဖွယ်ရှိသည်။H2B၊ HLA-A နှင့် HMGA1 အကြား တိုင်းတာသည့် သီးခြား adduct များကို ပုံ 5D တွင် ပြထားသည်။
HLA-A ၏ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု အများစုသည် ၎င်း၏ α1 နှင့် α2 ဒိုမိန်းများနှင့် မမှန်သော C-terminal ဒိုမိန်း (ပုံ. 6) အတွင်း ဖြစ်ပေါ်သည်။ဤဥပမာများထဲမှတစ်ခုတွင်၊ HLA-A သည် LRCH4 (ပုံ 6A၊D) ၏ မူမမှန်သော N-terminal အမြီးနှင့် ဓါတ်ပြုနေသည်ကို တွေ့ရှိရပါသည်။LRCH4 သည် TLR4 activation နှင့် LPS cytokine induction ကို ထိန်းညှိပေးသည်၊ ထို့ကြောင့် innate immune response60,61 ကို ပြုပြင်ပေးသည်။၎င်းသည် leucine-rich repeats (LRRs) ကိုးခုနှင့် ၎င်း၏ ectodomain ရှိ calmodulin (CH) homology motif ပါရှိသော အမြှေးပါးပရိုတင်းဖြစ်ပြီး၊ နောက်တွင် transmembrane domain (TMD) 60 , 62 ဖြစ်သည်။CH ဒိုမိန်းများသည် ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို 60 ပြေလည်စေရန် အစီရင်ခံထားသည်။LRR နှင့် CH ဒိုမိန်းများကြားတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ် 300 ခန့် ဆန့်ထုတ်နိုင်မှုမှာ အတော်လေး အဆင်ပြေသော်လည်း အဆင်မပြေပါ။ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်းကွန်ရက်များနှင့် အကြောသယ်ယူပို့ဆောင်ရေး 63 တို့၏ ဖျန်ဖြေပေးသူများအဖြစ် မူမမှန်သော ဒေသများ၏ လုပ်ဆောင်မှုအပေါ် အခြေခံ၍ ပရိုတင်း အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှု အများစုမှာ မူမမှန်သော ဒေသများတွင် ဖြစ်ပွားကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။MDN1 နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် LRR1၊ LRR6၊ CH ဒိုမိန်းများနှင့် ကျပန်းဒေသများအပါအဝင် ပရိုတင်း၏အရှည်တစ်လျှောက် ဖြန့်ဝေခဲ့ပြီး H2B သည် CH ဒိုမိန်း (ပုံ 6A၊ B) နှင့် အဓိကအကျုံးဝင်သည်။ထူးခြားသည်မှာ၊ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုတစ်ခုမှ CLMS ချဉ်းကပ်မှု၏တိကျမှုကို အကြံပြုသည့် TMJ (ပုံ 6A၊ B) မပါဝင်ပါ။
MDN1 ကို HLA-A ပရိုတိန်းကွန်ရက် (ပုံ 6A) ၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအဖြစ်လည်း ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။၎င်းသည် AAA ပရိုတိန်းအုပ်စုဝင် (ကွဲပြားခြားနားသောလုပ်ဆောင်မှုများနှင့်ဆက်စပ်နေသော ATPases) ဖြစ်သည်။၎င်းသည် hexameric ring တစ်ခုအဖြစ်ဖွဲ့စည်းပြီး 60S 64 ribosomal subunit မှ စည်းဝေးမှုအချက်အား ဖယ်ရှားသည့် N-terminal AAA ဒိုမိန်းဖြစ်သည်။dynein64,65,66 နှင့်ဆင်တူပုံရသည်။ထို့အပြင်၊ Asp/Glu ကြွယ်ဝသောဒေသကို MIDAS ဒိုမိန်း (သတ္တုအိုင်းယွန်းမှီခိုဆိုက်) ဖြင့် လိုက်နာသည်။MDN1 ၏ကြီးမားသောအရွယ်အစား (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် အမိုင်နိုအက်ဆစ် 5600 ခန့်) နှင့် ကောင်းစွာလေ့လာထားသော ပရိုတင်းများပါရှိသော အကန့်အသတ်ရှိသော သံတူကြောင်းကွဲများကြောင့် လူသားများတွင် ၎င်း၏ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် လုပ်ဆောင်မှုအကြောင်းကို အနည်းငယ်မျှ မသိရှိပါ။ကျွန်ုပ်တို့သည် HLA-A၊ H2B နှင့် LRCH4 ကို MDN1 တွဲဖက်လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များအဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့ပြီး PyMol တွင် ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးမှုများအဖြစ် ၎င်းတို့၏ တိမ်းညွှတ်မှုကို ဖော်ပြခဲ့သည် (ပုံ 6A၊B)။ဤပရိုတိန်းသုံးမျိုးသည် AAA ဒိုမိန်း၊ dynein-like linker domain နှင့် MIDAS MDN1 domain တို့နှင့် အကျိုးသက်ရောက်သည်။ယခင်အစီရင်ခံစာတွင်၊ ငါးစာပရိုတင်းများ၏ ရင်းနှီးမှုကို သန့်စင်ခြင်းသည် MDN1 သည် histone H2B67 နှင့်ဆက်စပ်နေသော ပရိုတင်းတစ်မျိုးအဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုက ကျွန်ုပ်တို့၏တွေ့ရှိချက်များကို ပံ့ပိုးပေးသည့် ပေါင်းစည်းမှု-သန့်စင်ထားသောအစုလိုက်အပြုံလိုက် spectrometry ကိုအသုံးပြုကာ MDN နှင့် HLA-B အကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကိုလည်း အစီရင်ခံခဲ့သည်။IFNα ကုသသောနမူနာများတွင် ဤရှုပ်ထွေးမှုကို ဖော်ထုတ်ခြင်းသည် interferon အချက်ပြခြင်းတွင် MDN1 အတွက် အခန်းကဏ္ဍကို အကြံပြုသည်။
HLA ဗီဇများသည် အလွန်ပေါများသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Flo-1 ဆဲလ်များ၏ RNA စီစစ်ခြင်းဒေတာမှ HLA-A၊ -B၊ နှင့် -C ကို မြေပုံဆွဲခြင်းမှ စီစစ်ခြင်းကို ထုတ်ယူထားသည် (ဒေတာမပြပါ)။စီစစ်ဖတ်ရှုခြင်းနှင့်အတူ လိုက်လျောညီထွေရှိသော Peptide sequences များသည် HLA-A၊ -B, နှင့် -C အကြား သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်များကို HLA-A (ပုံ S3) တွင် တည်ရှိသည့်နေရာများတွင် ဖော်ပြသည်။ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ပရိုတင်းများနှင့် HLA-B/C မော်လီကျူးများ၏ ပရိုတိန်းမှ ပရိုတင်း အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်မှုကို မတွေ့မိပါ။၎င်းသည် HLA-A၊ MDN1၊ LRCH1 နှင့် HMGA1 အကြားတွေ့ရှိရသော ပရိုတင်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် HLA-A အတိအကျဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုသည်။ထို့အပြင်၊ ချိတ်ဆက်မှုမရှိသောနမူနာများ (Table S4) ၏ proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် HLA-A သည် HLA-B သို့မဟုတ် HLA-C နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဆက်တိုက်လွှမ်းခြုံမှုပိုမိုမြင့်မားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။HLA-A အတွက်သတ်မှတ်ထားသော peptides များသည် IFNα ကုသထားသောနှင့် မကုသရသေးသောနမူနာနှစ်ခုစလုံးတွင် ပြင်းထန်မှုမြင့်မားပါသည်။
ဤနေရာတွင် ဖော်ပြထားသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် အနီးကပ် spatial proximity ရှိ ပရိုတင်းနှစ်ခု၏ သီးသန့်မဟုတ်သော အပြန်အလှန်လင့်ခ်ချိတ်ခြင်းကြောင့်မဟုတ်ကြောင်း သေချာစေရန်၊ co-immunoprecipitation assays လုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့် HLA-A အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်သည့်အချက်အသစ်နှစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ ထပ်မံအတည်ပြုခဲ့ပါသည်။HLA-A သည် endogenous MDN1 နှင့် H2B တို့နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို IFNα ကုသပြီး မကုသရသေးသော Flo-1 ဆဲလ်များ (ပုံ 7၊ ပုံ S4) နှစ်ခုလုံးတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။HLA-A ကို immunoprecipitates တွင် H2B မှ ဖမ်းယူထားကြောင်း၊ ဤဆက်စပ်မှုသည် IFNα ကုသမှုကြောင့်ဖြစ်ကြောင်း HLA-A သည် မကုသရသေးသောဆဲလ်များမှ immunoprecipitate နမူနာများ (ပုံ 7A) တွင် မရှိသည့်အတွက်ကြောင့်ဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ အတည်ပြုပါသည်။သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များအရ IFNα သည် HLA-A ချိတ်ဆက်မှုကို H2B နှင့် MDN1 သို့ ကွဲပြားစွာ ထိန်းညှိပေးကြောင်း အကြံပြုအပ်ပါသည်။IFNα သည် H2B နှင့် HLA-A အကြား ဆက်စပ်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်၊ သို့သော် MDN1 နှင့် ၎င်း၏ ဆက်စပ်မှုကို လျှော့ချသည်။MDN1 သည် ထိန်းချုပ်မှုများတွင် HLA-A နှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပြီး IFNα ၏ထပ်တိုးမှုသည် IFNα (ပုံ 7B,C) ဖြင့် MDN1 induction နှင့် ကင်းသော ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို လျော့ကျစေသည်။ထို့အပြင် HLA-A immunoprecipitation သည် A549 ဆဲလ်များတွင် H2B ကိုဖမ်းယူထားသည် (ပုံ။ S4)၊ ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် ဆဲလ်အမျိုးအစားနှင့်မကင်းကြောင်း အကြံပြုသည်။အတူတကွလုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့်၊ ဤရလဒ်များသည် H2B နှင့် MDN1 နှင့် HLA-A ၏ interferon- ကြားခံ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ပံ့ပိုးပေးသည်။
HLA-A သည် H2B နှင့် MDN1 ကို ပူးတွဲသန့်စင်သည်။ကိုယ်စားပြု endogenous H2B (A) နှင့် MDN1 (B) immunoblots များကို IFNα ကုသထားသော Flo-1 ဆဲလ်များမှ immunoprecipitated နှင့် ညွှန်ပြထားသော ပဋိပစ္စည်းများအတွက် စစ်ဆေးခဲ့သည်။မောက်စ်နှင့် ယုန် IgG ကို အနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။(ဂ) မတူညီသော အန်တီဂျန်များ၏ ဆက်စပ်ပမာဏ (ထည့်သွင်းမှု) ကို ညွှန်ပြသော ပဋိပစ္စည်းများကို ဆန့်ကျင်သည့် ခုခံအားစနစ်ဖြင့် သရုပ်ဖော်ထားပြီး၊ ဘီတာအက်တင်အား တင်တင်ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုသည်။
Interferon-Induced အလွန်ယုံကြည်စိတ်ချရသော အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသောကွန်ရက်များထဲမှတစ်ခုဖြစ်သည့် H2B-HLA-A-HMGA1 ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဂုဏ်သတ္တိများကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤရှုပ်ထွေးမှုတွင်ပါရှိသော ပရိုတင်းများ၏ ပုံသဏ္ဍာန်ဆိုင်ရာ ဒိုင်းနမစ်များကို နားလည်ရန် မော်လီကျူးဒိုင်းနမစ်ပုံစံကို အခြားနည်းလမ်းတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ 8)။CLMS ဒေတာမှ ကောက်ချက်ချမှုများသည် H2B၊ HLA-A နှင့် HMGA1 ပရိုတင်းများ၏ မတူညီသောပုံစံများ ဖြစ်နိုင်ခြေကို ညွှန်ပြသည်။ထို့ကြောင့်၊ အောက်ဖော်ပြပါ အလားအလာရှိသော ရှုပ်ထွေးမှုများကို ရည်ညွှန်းကြားခံအဖြစ် H2B-HLA-A၊ HMGA1-HLA-A နှင့် H2B-HLA-A-HMGA1 ဖြင့် စံပြခဲ့သည်။MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc.၊ Montreal၊ Quebec၊ Canada) မှ ပရိုတင်း-ပရိုတိန်း အချိတ်အဆွဲမျက်နှာပြင်သည် ဤပရိုတိန်းများအကြား ကွဲပြားနိုင်သည့် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ပုံစံများကို အကြံပြုထားသည်။docking ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးမှုကို မြင်ယောင်ခြင်းက အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုများနှင့် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ပုံစံများစွာကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 5A၊ 8)။ထို့ကြောင့် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ကိုက်ညီမှုတစ်ခုကို ပုံ 8A တွင် (တံဆိပ်တပ်ထားသော အပြန်အလှန်လင့်ခ်များဖြင့်) ပြထားပြီး ၎င်းကို MD မော်ဒယ်လ်ပိုက်လိုင်းကို အသုံးပြု၍ ထပ်မံအကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ထို့အပြင်၊ H2B သို့မဟုတ် HMGA1 နှင့် HLA-A တို့ကို ပေါင်းစည်းခြင်းသည် HLA-A အတွက် H2B ၏ ပိုမိုရင်းနှီးမှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည် (ပုံ။ 8A)။
H2B (H2BFS)-HLA-A၊ HMGA1-HLA-A နှင့် H2B-HLA-A-HMGA1 complexes များကြား ဖြစ်နိုင်သော ကွန်ရက်များ၏ ဖော်စပ်နိုင်သော ဒိုင်းနမစ်များ။(က) ဘယ်ဘောင်သည် 2D မြေပုံ (SIM-XL ဆော့ဖ်ဝဲလ်တွင် ထုတ်လုပ်သည်) ၏ အတွင်းပိုင်းမော်လီကျူး (အနီရောင်) နှင့် စပ်ကြားမော်လီကျူး (အပြာ) လင့်ခ်များ (ချိတ်ဆက်ဖြတ်တောက်မှု 3.5 ဟု သတ်မှတ်ထားသည်)။ထို့အပြင်၊ ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသော ချိတ်ဆက်ထားသော အကြွင်းအကျန်များကို H2B၊ HLA-A နှင့် HMGA1 ပရိုတင်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံများတွင် အညွှန်းတပ်ထားသည်။MOE ပက်ကေ့ချ်တွင် အကောင်အထည်ဖော်ဆောင်ရွက်သည့် အထိုင်ပိုက်လိုင်းကို အသုံးပြု၍ အဆိုပါပရိုတင်းများ၏ ဆက်စပ်ပုံစံများကို ထုတ်ယူခဲ့သည်။ဘယ်ဘက်အောက်ပိုင်းအကန့်သည် မတူညီသောပရိုတိန်း-ပရိုတိန်းချိတ်တွယ်မှုများ (GBVI/WSA dG; kcal/mol) နှင့် H2B-HLA-A နှင့် HMGA1-HLA-A ရှုပ်ထွေးမှုများ၏ ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ပုံစံအမျိုးမျိုးကို ပြသသည်။(ခ) ပရိုတိန်းဖွဲ့စည်းပုံတစ်ခုစီအတွက် အနုမြူအနေအထားများ (ဟိုက်ဒရိုဂျင်အက်တမ်များ မပါဝင်) စံသွေဖည်မှု (RMSD)။(ဂ) Intermolecular ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်း ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုး၏ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု ကြာချိန် ≥ 10 ns ၏ သီးခြားအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသည့် အမျိုးမျိုးသော ပေါင်းစပ်ရှုပ်ထွေးသော ရှုပ်ထွေးမှုများမှ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ။h-bond အလှူရှင်-လက်ခံသူဖြတ်တောက်မှုအကွာအဝေးကို 3.5 Å သတ်မှတ်ထားပြီး အလှူရှင်-H-လက်ခံကိရိယာဖြတ်တောက်ခြင်းထောင့်ကို ≥ 160°–180° သတ်မှတ်ထားသည်။(ဃ) HLA-A ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအဖြစ် ၎င်းတို့၏သက်ဆိုင်ရာလုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များနှင့် ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းထားသော တံဆိပ်တပ်ထားသည့် အကြွင်းအကျန်များသည် HLA-A-H2B နှင့် HLA-A-HMGA1 ရှုပ်ထွေးမှုများမှ ထုတ်နုတ်ထားသော ≥ 20 ns ၊ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံများသည် ပျမ်းမျှဖွဲ့စည်းပုံ 100 ns MDS ကိုကိုယ်စားပြုသည်။(င) HLA-A-H2B နှင့် HLA-A-HMGA1 ရှုပ်ထွေးမှုများကြားတွင် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် peptides နှစ်ခုကြားရှိ K သို့မဟုတ် S အပြန်အလှန်ဆိုက်အပေါ်အခြေခံ၍ 100 ns ကျော် H2B-HLA သရုပ်ဖော်မှုဖြင့် ခြေရာခံထားသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ။ရှုပ်ထွေးမှုများ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1။အပြန်အလှန်လင့်ခ်များကို အကဲဖြတ်ခြင်းအတွက် အတိုင်းအတာတန်ဖိုးကို 3.0 ဟု သတ်မှတ်ထားပြီး ≥ 10 ns ယူပြီး MDS မှ သီးခြားအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါသည်။ပရိုတိန်းဖွဲ့စည်းပုံများကို BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) နှင့် Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ပက်ကေ့ဂျ်များကို အသုံးပြု၍ ပုံဖော်ထားပါသည်။
အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ HLA-A မော်လီကျူးများ၏ တည်ငြိမ်မှု (စံသွေဖည်မှု၊ RMSD သို့မဟုတ် စံသွေဖည်မှု; RMSF) သည် ရှုပ်ထွေးမှုများတွင် H2B သို့မဟုတ် HMGA1 ပရိုတင်းများပါဝင်မှုသည် HLA-A (ပုံ 8B၊ ပုံ S5) ကို တည်ငြိမ်စေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။HMGA1 ပရိုတင်းသည် HLA-A ၏ B2M ဆိုက်နှင့် တင်းကျပ်စွာ ချည်နှောင်ထားပြီး HLA-A-HMGA1 သို့မဟုတ် H2B-HLA-A-HMGA1 ရှုပ်ထွေးသော HLA-A အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ တည်ငြိမ်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည် (ပုံ 8B၊ ပုံ S5)။အထူးသဖြင့်၊ HLA အကြွင်းအကျန်များ ~ 60-90 နှင့် ~ 180-210 တို့သည် H2B (ပုံ။ 8B) တွင် ပျော့ပြောင်းမှုနည်းသည်ကို တွေ့ရှိရသည်။H2B နှင့် HMGA1 သည် H2B-HLA-A-HMGA1 complex ရှိ HLA-A နှင့် H2B သို့မဟုတ် HMGA1 တစ်ခုတည်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက HLA-A နှင့် ပိုမိုကောင်းမွန်သော ချိတ်ဆက်မှုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 8C၊D; Table S5)။ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးတွင်ပါ၀င်သော အကြွင်းအကျန်များ (MD စံပြ မြင့်မားသောနေထိုင်မှု ≥ 10 ns) သည် ရှုပ်ထွေးသောရှိ CLMS အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုနေရာများ (K သို့မဟုတ် S အကြွင်းအကျန်များ) နှင့် တိုက်ဆိုင်ပြီး CLMS မှသတ်မှတ်ထားသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် အလွန်ယုံကြည်စိတ်ချရကြောင်း အကြံပြုပါသည်။ယုံကြည်စိတ်ချရမှု (ပုံ။ 8E )။CLMS နှင့် MD မော်ဒယ်ပုံစံတွင်၊ 190-210 ခန့်နှင့် အမိုင်နိုအက်ဆစ် 200-220 ခန့်ကြားရှိ HLA-A အကြွင်းအကျန်များသည် H2B နှင့် HMGA1 အသီးသီးကို ချည်နှောင်ရန် တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ။ 8E)။
ပရိုတိန်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုများသည် အချို့သော လှုံ့ဆော်မှုများကို တုံ့ပြန်ရာတွင် အတွင်းဆဲလ်များ ဆက်သွယ်မှုကို ပြေလည်အောင် ဆောင်ရွက်ပေးသည့် သွက်လက်သော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ကွန်ရက်များ ဖြစ်လာသည်။proteomics ချဉ်းကပ်မှုအများအပြားသည် ပရိုတိန်း၏တည်ငြိမ်သောအခြေအနေအဆင့်တွင်ပြောင်းလဲမှုများကိုရှာဖွေတွေ့ရှိသောကြောင့်၊ ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုဒိုင်းနမစ်များသည် binding interfaces များကိုဖမ်းယူရန်နောက်ထပ်ကိရိယာများလိုအပ်ပြီး CLMS သည် ထိုကဲ့သို့သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်သည်။အင်တာဖာရွန် အချက်ပြစနစ်သည် ဆဲလ်များသည် ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာရောဂါဖြစ်ပွားစေသော နှင့် ပင်ကိုယ်ရောဂါဆိုင်ရာအချက်ပြမှုများကို တုံ့ပြန်ရန် ဆဲလ်များကိုခွင့်ပြုကာ interferon-inducible ပရိုတိန်း၏ အစုခွဲများအဖြစ် နိဂုံးချုပ်စေပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် interferon ဖြစ်ပေါ်စေသောပရိုတိန်းများ၏အကန့်တစ်ခုတွင် ဆန်းသစ်သောပရိုတင်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် CLMS ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။Interferon-responsive Flo-1 ဆဲလ်ပုံစံတစ်ခုရှိ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ ပရိုတိန်း ချိတ်ဆက်ခြင်းဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပရိုတင်းရှုပ်ထွေးမှုကို ဖမ်းယူရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ကူးယူချိတ်ဆက်ထားသောမဟုတ်သောနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသောဆဲလ်များမှ tryptic peptides များကို ထုတ်ယူခြင်းသည် peptide ကိုရေတွက်ခြင်း၊ လမ်းကြောင်းဖြည့်တင်းခြင်းနှင့် peptide အရှည်ဖြန့်ဖြူးခြင်းကို သတ်မှတ် LFQ ပြင်းထန်မှုဖြင့် ခွင့်ပြုသည်။Canonical interferon-inducible ပရိုတင်းများကို အပြုသဘောဆောင်သော အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုအဖြစ် ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး၊ MX1၊ UP18၊ OAS3 နှင့် STAT1 ကဲ့သို့သော canonical interferon-inducible ပရိုတင်းများ၏ interferon-inducible ပရိုတင်းများကို လေ့လာတွေ့ရှိရပါသည်။လုပ်ငန်းလည်ပတ်မှုနယ်ပယ်များတွင် အမျိုးမျိုးသောဖွဲ့စည်းပုံသဏ္ဍာန်များနှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို စူးစမ်းလေ့လာခဲ့သည်။
HLA-A၊ MDN1 နှင့် H2B အကြား အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို IFNα ဖြင့် ကုသပြီး မကုသသော Flo-1 နှင့် A549 ဆဲလ်များတွင် immunoblotting ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် HLA-A သည် H2B နှင့် IFNα-မူတည်သည့်ပုံစံဖြင့် ရှုပ်ထွေးကြောင်း မီးမောင်းထိုးပြသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏အလုပ်သည် ဤရှုပ်ထွေးမှုနှစ်ခု၏ ပူးတွဲဒေသခွဲဝေမှုကို ထပ်မံရှာဖွေရန်အတွက် စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသောလမ်းကို ကိုယ်စားပြုပါသည်။ဆဲလ်အမျိုးအစား-အမှီအခိုကင်းသော interferon-ဖျော့ဖျော့ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် CLMS ချဉ်းကပ်မှုအား ဆဲလ်လိုင်းအကန့်တစ်ခုသို့ ချဲ့ထွင်ရန်လည်း စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းပါသည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရင်ကြားမော်လီကျူလာနှင့် စပ်ကြားမော်လီကျူး အပြန်အလှန်စကားပြောဆိုမှုများကို ခြေရာခံသည့် H2BFS-HLA-A-HMGA1 ရှုပ်ထွေးမှုတွင်ပါရှိသော ပရိုတင်းများ၏ ညီညွတ်သော ဒိုင်းနမစ်များကို နားလည်ရန် MD မော်ဒယ်လ်ကို အခြားနည်းလမ်းတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။CLMS ဒေတာမှ ကောက်ချက်ချမှုများသည် H2BFS၊ HLA-A နှင့် HMGA1 ပရိုတင်းများ၏ မတူညီသောပုံစံများ ဖြစ်နိုင်ခြေကို ညွှန်ပြသည်။ဤ docking protein complexes များကြားဖြစ်နိုင်သော ကွဲပြားသောပုံစံများသည် CLMS dataset တွင်တွေ့ရှိရသော တုံ့ပြန်မှုများနှင့် ဆင်တူသည့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ဖော်ထုတ်ပြသပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်း၏အဓိကအားသာချက်တစ်ခုမှာ HLA ကဲ့သို့သော polymorphic genes များကဲ့သို့အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကိုလွယ်ကူစွာခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သောကြောင့်လေ့လာရန်ခက်ခဲသော HLA haplotype-specific proteins များ၏အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကိုလေ့လာရန်စိတ်ဝင်စားဖွယ်ဖြစ်လိမ့်မည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် CLMS သည် interferon-induced signaling networks များအကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏နားလည်မှုကို ချဲ့ထွင်ရန်နှင့် tumor microenvironment ရှိ ပိုမိုရှုပ်ထွေးသော intercellular စနစ်များကို လေ့လာရန်အတွက် အခြေခံတစ်ခုအဖြစ် ပံ့ပိုးပေးသည့် CLMS ကို အသုံးပြုနိုင်ကြောင်း သက်သေပြပါသည်။
Flo-1 ဆဲလ်များကို ATCC မှရရှိပြီး DMEM (Gibco) တွင် ထိန်းသိမ်းထားသော 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen) 10% သန္ဓေသားသွေးရည်ကြည် (Gibco) နှင့် 37°C နှင့် 5% CO2 တွင် သိုလှောင်ထားသည်။ပေါက်ဖွားခြင်း။IFNα14 (Edinburgh Protein Production Facility မှထုတ်လုပ်သည်) ဖြင့် မကုသမီတွင် ဆဲလ်များကို 70-80% ဆုံရာအထိ ကြီးထွားလာခဲ့သည်။အခြားဓာတုပစ္စည်းများနှင့် ဓာတ်ပစ္စည်းများအားလုံးကို Sigma Aldrich မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်
Flo-1 ဆဲလ်များကို ရေတွင်းအပြား 6 ခုတွင် မွေးမြူပြီး နောက်တစ်နေ့တွင် ဆဲလ်များကို 10 ng/ml IFNα14 ဖြင့် 24 နာရီကြာ ကုသပြီး ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 80% အထိ ပေါင်းစည်းခဲ့သည်။ဆဲလ်များကို PBS ဖြင့် သုံးကြိမ်ဆေးကြောပြီး အသစ်ပြင်ဆင်ထားသော DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO တွင်ပျော်ဝင်သည်) နှင့် PBS တွင် 37°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ 37°C. နောက်ဆုံးပြင်းအား 0.5 mM အထိ ပေါင်းစပ်ထားသည်။DSS crosslinking တုံ့ပြန်မှုကို PBS ဖြင့် အစားထိုးလိုက်ပြီး ကျန်ရှိသော DSS ကို PBS တွင် 20 mM Tris (pH 8.0) ကို 37°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် မီးငြိမ်းသွားပါသည်။ဆဲလ်များကို ခြစ်ထုတ်ပြီး အနှောင်အဖွဲ့နည်းသော ပြွန်များ (Axygen) ဖြင့် စုဆောင်းသည်။
ဆဲလ်အခွံကို ရံဖန်ရံခါလှုပ်ရမ်းခြင်းဖြင့် အခန်းအပူချိန်တွင် 30 မိနစ်ကြာ ယူရီးယား lysis ကြားခံ (8 M ယူရီးယား၊ 0.1 M Tris၊ pH 8.5) ဖြင့် lysed လုပ်ထားသည်။8°C တွင် 14,000 xg တွင် centrifugation အဆင့်များ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။lysate ကို 10 မိနစ်ကြာဗဟိုပြုပြီး supernatant ကိုပြွန်အသစ်သို့လွှဲပြောင်းပါ။ကျန်ရှိသောရှင်းလင်းသောအမှုန်များကိုဒုတိယ lysis ကြားခံ (2 M urea၊ 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate))) ၏ 150 μl တွင် ပျော်ဝင်ပြီး တစ်သားတည်းသောရေကိုရရှိသည်အထိ မိနစ် 30 သို့မဟုတ်ထိုထက်ပို၍ပျော်ဝင်ခဲ့သည်။lysate ကို မိနစ် 20 ကြာ အာရုံစူးစိုက်ထားပြီး လွန်လွန်ကဲကဲကို ယခင်အဆင့်တွင်ရရှိသော lysate နှင့် ရောစပ်ထားသည်။မိုက်ခရိုပလိတ်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအတွက် ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်အရ ပရိုတင်းပါဝင်မှုအား Micro BCA စစ်ဆေးမှု (Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။နမူနာများကို နိုက်ထရိုဂျင်အရည်တွင် အေးခဲပြီး -80°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။
Wisniewski et al မှ ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း မွမ်းမံထားသော filtration နမူနာပြင်ဆင်မှုပရိုတိုကော (FASP) ကို အသုံးပြု၍ ပျော်ဝင်နိုင်သော ချိတ်ဆက်ထားသော ပရိုတင်း 100 μg ခန့်ကို စီမံဆောင်ရွက်ခဲ့ပါသည်။69 အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ ပရိုတင်းကို ယူရီးယားကြားခံ 200 µl (ယူရီးယား 0.1 M Tris တွင် 8 M ယူရီးယား၊ pH 8.5) ဖြင့် ဖြတ်ပြီး တစ်ဝက်ခန့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။25°C တွင် 14,000 xg တွင် centrifugation အဆင့်များ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။Cross-linked protein lysate ၏ ပထမနှစ်ဝက်ကို Ultracel-10 အမြှေးပါး (Merck) တပ်ဆင်ထားသော 10 kDa Microcon centrifugal filter ကိရိယာသို့ လွှဲပြောင်းခဲ့ပြီး၊ ထို့နောက် ဇကာပေါ်တွင် centrifugation ဖြင့် 25 မိနစ်ကြာ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ထို့နောက် ဇကာထဲသို့ ပရိုတင်း၏ ဒုတိယတစ်ဝက်ကို ထည့်ကာ တူညီသော အဆင့်များကို ပြန်လုပ်ပါ။ယူရီးယားကြားခံတွင် 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) ၏ 100 μl ကို ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် ပရိုတင်းပြန်လည်ရယူခြင်းကို လုပ်ဆောင်သည်။ပြန်လည်ရယူခြင်းကို 37°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ အပူချိန် 600 rpm တွင် ရောမွှေထားသည်။ထို့အပြင်၊ ကော်လံကို ဗဟိုပြု၍ ချိတ်ဆက်ထားသော ပရိုတင်းကို ယူရီးယားကြားခံတွင် 100 μl ၏ 50 mM iodoacetamide ကို အသုံးပြု၍ အယ်လ်ကီဒိတ်လုပ်ထားသည်။အမှောင်ထဲတွင် မိနစ် 20 ကြာ alkylation တုံ့ပြန်မှုကို အခန်းအပူချိန်တွင် လုပ်ဆောင်သည်။ကော်လံကို လှည့်ပါ၊ ကော်လံနံရံများကို 100 µl ယူရီးယားကြားခံဖြင့် ၃ ကြိမ်ဆေးပါ၊ ထို့နောက် အာရုံစူးစိုက်မှုပြုလုပ်ပါ။100 mM ammonium bicarbonate 100 μl ၏ 100 μl ကို အသုံးပြု၍ အလားတူခွဲစိတ်မှုကို ၃ ကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။trypsinization မလုပ်မီ၊ collection tube ကို အသစ်တစ်ခုဖြင့် အစားထိုးပါ။trypsin ကြားခံ (Promega) တွင် 50 mM ammonium bicarbonate နှင့် 1 µl trypsin ပါဝင်သော အစာခြေကြားခံကို ပေါင်းထည့်ပါ။trypsin နှင့် ပရိုတင်းအချိုးကို 1:33 ခန့်တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး စိုစွတ်သောအခန်းတွင် 37°C. ညတွင်းချင်းပင် အစာခြေတုံ့ပြန်မှုကို ပေါက်ဖွားစေပါသည်။crosslinked peptide ကို 25 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် ဇကာမှ ဖယ်ထုတ်ခဲ့သည်။Peptide ပြန်လည်ရယူခြင်းကို ဇကာထဲသို့ 50 μl ၏ 0.5 M NaCl ပေါင်းထည့်ကာ 25 မိနစ်ကြာ centrifugation ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် တိုးတက်ကောင်းမွန်လာပါသည်။
Bouchal et al.70 မှဖော်ပြသော ပရိုတိုကောပြီးနောက် အနည်းငယ်သောပြုပြင်မွမ်းမံမှုများနှင့်အတူ C18 Micro Spin ကော်လံများ (Harvard Apparatus) ကို အသုံးပြုထားသည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ C18 လှည့်ပတ်ကော်လံများကို acetonitrile (AcN) (Merck) တွင် 0.1% ဖော်မြူလာအက်ဆစ် (FA) သုံးကြိမ်နှင့် 0.1% FA နှစ်ကြိမ် ဆေးကြောခြင်းဖြင့် အသက်သွင်းခဲ့သည်။ကော်လံကို 15 မိနစ်ကြာ 0.1% FA ဖြင့် ရေဓာတ်ဖြည့်ထားသည်။နမူနာများကို လှည့်ပတ်ကော်လံများထဲသို့ထည့်ကာ 0.1% FA ဖြင့် ၃ ကြိမ်ဆေးပါ။desalted peptides များကို 0.1% FA တွင် 50%, 80% နှင့် 100% AcN ကို အသုံးပြု၍ အဆင့်အလိုက် gradient ဖြင့် ဆင့်ကဲ နှုတ်ယူခဲ့သည်။နမူနာများကို SpeedVac Plus အာရုံစူးစိုက်မှု (Eppendorf) တွင် အခြောက်ခံပြီး ကျန်အရည်များကို လုံးဝပျောက်ကွယ်သွားသည်အထိ ပြုလုပ်ထားသည်။eluted peptides များကို 2.5% AcN တွင် 0.08% trifluoroacetic acid 100 μl တွင် ပျော်ဝင်ပြီး ပြင်းအားကို NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) တွင် တိုင်းတာခဲ့ပါသည်။နမူနာတစ်ခုလျှင် ချိတ်ဆက်ထားသော ချိတ်ဆက်ထားသော Peptide 1 μg ခန့်ကို LC-MS/MS စနစ်ထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။
Cross-linked peptides များကို Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော UltiMate 3000 RSLCnano LC စနစ် (Thermo Scientific) တွင် ပိုင်းခြားထားသည်။Cross-linked peptides များကို C18 PepMap100 sorbent နှင့် 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ဖြင့်ထုပ်ပိုးထားသော 5 မီလီမီတာရှည်သော µ-pre-ကော်လံ C18 ကော်လံတွင် ချိတ်ဆက်ထားသော peptides များကို စုဆောင်းထားပါသည်။2.5% AcN တွင် ပျော်ဝင်နေသော trifluoroacetic acid ကို 5 µl/min တွင် 5 µl/min တွင် ထည့်သွင်းပါ။Cross-linked peptides များကို အတွင်းပိုင်းအချင်း 75 μm နှင့် 150 mm ရှိသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသော ပေါင်းစပ်ထားသော ဆီလီကာကော်လံပေါ်တွင် ပိုင်းခြားထားပြီး 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ဖြင့် ပိုင်းခြားထားသည်။မိုဘိုင်းအဆင့် A နှင့် B တွင် ရေတွင် 0.1% FA နှင့် acetonitrile တွင် 0.1% FA အသီးသီးပါဝင်ပါသည်။gradient သည် 2.5% B မှစတင်ပြီး 90 မိနစ်ကျော်တွင် 40% B သို့ linearly တိုးလာပြီး နောက် 2 မိနစ်တွင် 90% B သို့တိုးလာပါသည်။မိုဘိုင်းအဆင့်ဖွဲ့စည်းမှုအား 90% B တွင် 10 မိနစ်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားပြီး 2 မိနစ်အတွင်း 2.5% B သို့ မျဉ်းကြောင်းအတိုင်း လျော့ကျသွားသည်။ကော်လံကို 2.5% B တွင် နောက်စက်ဝိုင်းမစတင်မီ 8 မိနစ်အတွင်း ညီမျှသည်။ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကော်လံမှ ဖယ်ထုတ်ထားသော ချိတ်ဆက်ထားသော ချိတ်ဆက်ထားသော ပက်ပိုက်များကို နာနိုအီလက်ထရော့စပရေးအိုင်းယွန်း (NSI) အရင်းအမြစ်တွင် အိုင်ယွန်ဖြစ်စေပြီး Exploris 480 အစုလိုက်အပြုံလိုက် ရောင်စဉ်မီတာ (သာမိုသိပ္ပံပညာ) သို့ ထိုးသွင်းသည်။
Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer သည် အပြုသဘောဆောင်သော ဒေတာဆက်စပ်မှုမုဒ်တွင် လုပ်ဆောင်သည်။m/z 350 Th မှ m/z 2000 Th မှ အကွာအဝေး ဆက်တင်များဖြင့် 120,000 resolution ရှိသော အပိုင်းမုဒ်တွင် အပြည့်အစုံစကင်န်ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ပုံမှန်ပြုလုပ်ထားသော AGC ပစ်မှတ်အား အမြင့်ဆုံးထည့်သွင်းချိန် 50ms ဖြင့် 300% သတ်မှတ်ထားသည်။Monoisotopic peak detection ကို peptides အတွက် တည်ထောင်ထားသည်။ရှေ့ပြေးနိမိတ်များ အလွန်နည်းသည်ကို တွေ့ရှိပါက ကန့်သတ်မှု ဖြေလျှော့မှု ကန့်သတ်ဘောင်ကို အမှန်ဟု သတ်မှတ်သည်။ရှေ့ပြေးဇာတာ၏ အနိမ့်ဆုံး အိုင်ယွန်အားအား 5.0e3 သို့ သတ်မှတ်ထားပြီး စမ်းသပ်မှုများတွင် ရှေ့ပြေးအားသွင်းမှု အခြေအနေသည် +8 အထိ ပါဝင်ပါသည်။
ဒေတာဆက်စပ်မှုမုဒ်ရှိ အဓိကစကင်န်ဖတ်မှုများကြား လည်ပတ်ချိန်ကို 2.5 စက္ကန့် သတ်မှတ်ထားသည်။ရှေ့ပြေးအိုင်းယွန်း၏ ပထမဆုံးအစိတ်စိတ်အမြွှာမြွှာကွဲပြီးနောက် ဒိုင်းနမစ်အစုလိုက်အပြုံလိုက် ဖယ်ထုတ်ခြင်းကို 20 စက္ကန့်ဟု သတ်မှတ်သည်။ရှေ့ပြေးအထီးကျန်ဝင်းဒိုးကို 2 Th သို့ သတ်မှတ်ထားသည်။ဒေတာကိုမူတည်သည့် MS/MS စကင်န်တွင် ပုံသေတိုက်မှုစွမ်းအင်မုဒ်ဖြင့် ပုံမှန်ပြုလုပ်ထားသော တိုက်မိမှုစွမ်းအင်အမျိုးအစားကို ရွေးချယ်ထားသည်။တိုက်မိခြင်းစွမ်းအင်ကို 30% သတ်မှတ်ထားသည်။Orbitrap Resolution ကို 15,000 သို့သတ်မှတ်ထားပြီး AGC သည် 100% အထိဖြစ်သည်။စိတ်ကြိုက် အမြင့်ဆုံး ဆေးထိုးချိန်ကို 60 မီလီစက္ကန့် သတ်မှတ်ထားသည်။
ချိတ်ဆက်ထားသောနမူနာများတွင် ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်းကွန်ရက်ကို ခြေရာခံခြင်းမပြုမီ၊ နမူနာများတွင် ခြေရာခံနိုင်သော peptides/proteins ကိုခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် MaxQuant ပက်ကေ့ဂျ် (ဗားရှင်း 1.6.12.0)26,27 ကို အသုံးပြု၍ ကုန်ကြမ်းဖိုင်များကို စီမံဆောင်ရွက်ခဲ့ပါသည်။ထို့အပြင်၊ အလားတူပရိုတီအိုမစ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို IFNα ဖြင့် ကုသပြီး မကုသရသေးသော Flo-1 နမူနာများပေါ်တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။MS/MS ဒေတာကို UniProt လူသားဒေတာဘေ့စ် (www.uniprot.org) တွင် (သြဂုတ်လ 12 ရက်၊ 2020 တွင် အပ်လုဒ်လုပ်ထားပြီး၊ ထည့်သွင်းထားသော ရှာဖွေရေးအင်ဂျင် Andromeda27 ကို အသုံးပြု၍ 75,093 ထည့်သွင်းထားသည်) တွင် ရှာဖွေခဲ့သည်။အင်ဇိုင်း၏ တိကျမှုနှင့် deamidation (N, Q) နှင့် oxidation (M) ၏ အမျိုးမျိုးသော ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများကို ဖော်ပြခြင်းမပြုဘဲ ရှာဖွေမှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ရှေ့ပြေးဒြပ်ထုသည်းခံမှုကို 20 ppm နှင့် ထုတ်ကုန်အိုင်းယွန်း 0.02 Da တွင်သတ်မှတ်ထားသည်။ကနဦးနှင့် အမြင့်ဆုံး ဒြပ်ထုသွေဖည်မှုကို 10 ppm ဟု သတ်မှတ်ခဲ့သည်။peptide ၏ အမြင့်ဆုံးထုထည်ကို 4600 Da တွင်သတ်မှတ်ထားပြီး တူညီသော sequence ကို 7 နှင့် 25 amino acids (aa) အကြားသတ်မှတ်ထားသည်။Perseus ပရိုဂရမ် (ဗားရှင်း 1.6.10.45) ကို အသုံးပြု၍ နောက်ထပ် ကိန်းဂဏန်းဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ပရိုတင်းပါဝင်မှုကို ပရိုတင်း၏ရောင်စဉ်တန်းပြင်းအား (LFQ ပြင်းထန်မှု၊ တံဆိပ်မပါသော ပမာဏ) 27 ကို ပုံမှန်ဖြစ်စေခြင်းဖြင့် တွက်ချက်ပြီး ပြင်းထန်မှုတန်ဖိုးများကို Log2 သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။၎င်းတို့၏ peptide ပြင်းထန်မှုဖြင့် သတ်မှတ်ထားသော ပရိုတင်းများ၏ အထက်အောက် အစုအဝေးတစ်ခုကို R (v 4.1.2) တွင် phheatmap (v1.0.12) ပက်ကေ့ဂျ်ကို အသုံးပြု၍ တည်ဆောက်ထားသည်။မကုသရသေးသောနမူနာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက လေးဆကျော် အသက်သွင်းထားသည့် IFNα ကုသထားသော ပရိုတိန်းများအတွက် Reactome လမ်းကြောင်း ဒေတာဘေ့စ်ကို အသုံးပြု၍ လမ်းကြောင်းကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
LC-MS/MS မှစောင့်ကြည့်ထားသော ပရိုတင်းရှုပ်ထွေးမှုများ၏ lysine (K) သို့မဟုတ် serine (S) သီးခြား ဓာတုအချိတ်အဆက်များကို ဖော်ထုတ်ခြင်းအား cross-linked peptides (SIM-XL)29 အတွက် spectroscopic identification machine (SIM-XL) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ပထမဦးစွာ၊ Padariya et al.28 တွင်ဖော်ပြထားသော IRDS ပရိုတိန်းဒေတာအတွဲကို အသုံးပြု၍ interferon-sociated (IFN) DNA ပျက်စီးမှုခံနိုင်ရည်လက်မှတ် (IRDS) ဗီဇများအကြား ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို စုံစမ်းခဲ့သည်။လူသား UniProt တစ်ခုလုံး၏ အခြေအနေအားလုံးကို စစ်ဆေးခြင်းနှင့် ထပ်ခါတလဲလဲ စစ်ဆေးခြင်းမှာ တွက်ချက်မှုအရ အလွန်အကျုံးဝင်သောကြောင့် လူသား UniProt ဒေတာဘေ့စ် (www.uniprot.org) တစ်ခုလုံး (ဩဂုတ်လ 12 ရက် 2020 တွင် ဒေါင်းလုဒ်လုပ်ထားသော IFNα ကုသထားသော ထပ်ခါတလဲလဲများနှင့် ကိုက်ညီသော ထည့်သွင်းမှုများ 75,093) ပါဝင်ပါသည်။ယုံကြည်မှုမြင့်မားသော အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများအတွက် စစ်ထုတ်မှုများထဲမှတစ်ခု။ရရှိသော မြင့်မားသော အရေးပါသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို ချဲ့ထွင်ပြီး ထပ်ခါတလဲလဲနှင့် အခြေအနေအားလုံးတွင် စမ်းသပ်ခဲ့သည်။
SIM-XL တွင်၊ DSS ကို crosslinker (XL) အတွက် အသုံးပြုပြီး XL အလေးချိန်ပြောင်းခြင်းနှင့် ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းအလေးချိန်ပြောင်းခြင်းကို 138.06 နှင့် 156.07 အသီးသီး သတ်မှတ်ထားသည်။ဖော်ပြပါ linking တုံ့ပြန်မှုဆိုက်များကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသည်- KK၊ KS နှင့် KN-TERM၊ သတင်းထောက်အိုင်းယွန်းများမပါဘဲ။ရှေ့ပြေးနိမိတ်နှင့် အပိုင်းအစ ppm နှစ်ခုလုံးကို 20 ဟုသတ်မှတ်ထားပြီး Xrea အဆင့်ကို 0.15 ဟုသတ်မှတ်ထားသည်။Trypsin သည် လုံးဝတိကျသည်ဟု ယူဆရပြီး စွမ်းအင်မြင့် C-trap (HCD) အပိုင်းပိုင်းခွဲနည်းကို အကောင်အထည်ဖော်ခဲ့သည်။XCorr ဒိုင်နမစ် DB လျှော့ချရေး ကန့်သတ်ချက်နှင့် ဒိုင်နမစ် DB လျှော့ချမှုအတွက် အနည်းဆုံး peptides အရေအတွက်ကို 2.5 နှင့် 2 အသီးသီး သတ်မှတ်ထားသည်။အခြားကန့်သတ်ချက်များမှာ- monoisotope ဖြစ်နိုင်ခြေနှင့် အထွတ်အထိပ် တိုက်ဆိုင်မှုဖြတ်တောက်မှု၊ ကြိုးတစ်ချောင်းလျှင် အနည်းဆုံး AA အကြွင်းအကျန် 4 ခုနှင့် အများဆုံးကြိုးမျှင်အားသွင်းမှု၊ နှင့် လွတ်သွားသောခွဲခြမ်းများ၏ အမြင့်ဆုံး 3 ခု။ရရှိလာသော ချုပ်ရိုးထားသော 2D မြေပုံများကို (SIM-XL) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး 2D မြေပုံများကို တည်ဆောက်ရန်အတွက် xQuest28 ဂရပ်ဖစ်ကိုယ်စားပြုမှုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ပရိုတင်းတည်ဆောက်ပုံများပေါ်ရှိ ပရိုတိန်းအချိတ်အဆက်များကို PyMol (PyMOL Molecular Graphics System၊ ဗားရှင်း 2.0 Schrödinger၊ LLC) တွင် ပေးဆောင်ထားပါသည်။
ပရိုတိန်း မော်ဒယ်တည်ဆောက်ပုံများကို Phyre2 ဆာဗာ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 "Hidden Markov Method" ကို အကောင်အထည်ဖော်ခြင်း၏ အခြေခံမူများကို အသုံးပြု၍ ဖန်တီးထားသည်။Phyre2 သည် လူသိများသော ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံများနှင့် အစီအစဥ်ချိန်ညှိမှုအပေါ် အခြေခံ၍ မော်ဒယ်ဖွဲ့စည်းပုံများကို ထုတ်ပေးသည်။H2BFS၊ HLA-A၊ HMGA1၊ LRCH4၊ နှင့် MDN1 ပရိုတင်းများအတွက်၊ နမူနာပုံစံများကို 1kx552၊ 1kj349၊ 2eze55၊ 6hlu62 နှင့် 6i2665 ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ထို့အပြင် AlphaFold71 MX1၊ UBP18 နှင့် ROBO1 ၏ ဖွဲ့စည်းပုံကိုလည်း ထည့်သွင်းစဉ်းစားခဲ့သည်။ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံအား BIOVIA Discovery Studio Visualizer package (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) နှင့် Molecular Operating Environment package (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) တို့ကို အသုံးပြု၍ မြင်သာထင်သာမြင်သာအောင် ပြုလုပ်ထားပါသည်။