347 12.7*1.24mm Stainless steel coiled tubing၊ synchronous electrostatic condensation and coaggregation of α-synuclein နှင့် tau ၏ မော်လီကျူးယန္တရား

Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။
ဆလိုက်တစ်ခုလျှင် ဆောင်းပါးသုံးပုဒ်ကို ပြသသည့် ဆလိုက်ဒါများ။ဆလိုက်များတစ်လျှောက် ရွှေ့ရန် နောက်ဘက်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် ဆလိုက်တစ်ခုစီကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ထိန်းချုပ်မှုခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။

347 Stainless Steel Pipe Specification

347 12.7*1.24mm Stainless steel coiled tubing

ပြင်ပအချင်း- 6.00 မီလီမီတာ OD မှ 914.4 မီလီမီတာ OD အထိ၊ အရွယ်အစား 24” NB အထိရရှိနိုင်သော Ex-stock၊ OD အရွယ်အစား သံမဏိ Tubes များ ရရှိနိုင်ပြီ Ex-stock

SS 347 ပိုက်အထူ အပိုင်းအခြား- 0.3mm – 50 mm၊ SCH 5၊ SCH10၊ SCH 40၊ SCH 80၊ SCH 80S၊ SCH 160၊ SCH XXS၊ SCH XS
WT- SCH5S၊ SCH10S၊ SCH40S၊ SCH80S၊ SCH160S စသည်ဖြင့် (0.5-12mm) သို့မဟုတ် လိုအပ်သလို အံဝင်ခွင်ကျဖြစ်စေရန် ပုံမှန်မဟုတ်သော အရွယ်အစား

အမျိုးအစား- SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW ပိုက်များ |SS 347 Welded Pipes |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW Tubes၊ LSAW Pipes / Seam-welded / Redrawn

ပုံစံ- SS 347 အဝိုင်းပိုက်များ/ပြွန်များ၊ SS 347 စတုရန်းပိုက်များ/ပြွန်များ၊ SS 347 လေးထောင့်ပိုက်များ/ပြွန်များ၊ SS 347 ဆံထုံးပိုက်များ၊ SS 347 “U” ပုံသဏ္ဍာန်၊ SS 347 ပန်ကိတ်ကွိုင်များ၊ SS 347 ဟိုက်ဒရောလစ်ပြွန်များ

အလျား- တစ်ကိုယ်ရေ ကျပန်း၊ နှစ်ချက် ကျပန်းနှင့် လိုအပ်သော အရှည်အဆုံး- ရိုးရိုးအဆုံး၊ အစွန်းတစ်ဖက်၊ နင်းထားသော

End Protection: ပလပ်စတစ်ထုပ်များ |အပြင်ဘက် Finish- 2B၊ No.4၊ No.1၊ No.8 Mirror Finish for Stainless Steel Pipes၊ customer လိုအပ်ချက်အရ ပြီးအောင်လုပ်ပါ။

ပို့ဆောင်မှုအခြေအနေ- ဖျက်သိမ်းပြီး နှပ်ထားသော၊ ပွတ်သည်၊ တောက်ပြောင်သော၊ အအေးခံထားသော၊

စစ်ဆေးခြင်း၊ စမ်းသပ်ခြင်းအစီရင်ခံစာများ- Mill Test Certificates၊ EN 10204 3.1၊ ဓာတုအစီရင်ခံစာများ၊ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာအစီရင်ခံစာများ၊ PMI စစ်ဆေးမှုအစီရင်ခံစာများ၊ Visual Inspection Reports၊ Third Party Inspection Reports၊ NABL Approved Lab Reports၊ Destructive Test Reports၊ Non Destructive Test Reports

ထုပ်ပိုးခြင်း- သစ်သားသေတ္တာများ၊ ပလပ်စတစ်အိတ်များ၊ သံမဏိပြားများဖြင့် ထုပ်ပိုးထားသော သို့မဟုတ် ဖောက်သည်များတောင်းဆိုချက်အရ၊

အထူးများ- အထက်ဖော်ပြပါ အရွယ်အစားများနှင့် သတ်မှတ်ချက်များသည် တောင်းဆိုမှုအရ ထုတ်လုပ်နိုင်ပါသည်။

SS 347 ပိုက်အရွယ်အစား အပိုင်းအခြား- 1/2 လက်မ NB၊ OD မှ 24 လက်မ

ASTM A312 347- မြင့်မားသောအပူချိန်နှင့် ယေဘူယျအဆိပ်သင့်ခြင်းဝန်ဆောင်မှုအတွက် ရည်ရွယ်သော ချောမွေ့မှုမရှိသော ချုပ်ရိုးဂဟေဆက်ထားသော austenitic ပိုက်။ဂဟေဆော်နေစဉ်အတွင်း Filler သတ္တုကို ခွင့်မပြုပါ။

ASTM A358 347- သံဓာတ်နှင့်/သို့မဟုတ် မြင့်မားသောအပူချိန်ဝန်ဆောင်မှုအတွက် အက်စတီနစ်ပိုက်ကို လျှပ်စစ်ပေါင်းစပ်ထားသော ဂဟေဆော်သည်။ပုံမှန်အားဖြင့် ဤသတ်မှတ်ချက်အရ 8 လက်မအထိ ပိုက်များကိုသာ ထုတ်လုပ်ပါသည်။ဂဟေဆော်နေစဉ်အတွင်း အဖြည့်ခံသတ္တုထည့်ခြင်းကို ခွင့်ပြုသည်။

ASTM A790 347- ယေဘုယျအားဖြင့် သံချေးတက်ခြင်းဝန်ဆောင်မှုအတွက် ရည်ရွယ်သော ချောမွေ့သောနှင့် ဖြောင့်စင်းသော ဂဟေဆက်ထားသော ferritic/austenitic (duplex) ပိုက်သည် ဖိစီးမှု ချေးကွဲအက်ခြင်းကို ခံနိုင်ရည်ရှိစေရန် အထူးအလေးပေးထားသည်။

ASTM A409 347- ဖြောင့်-ချုပ်ရိုး သို့မဟုတ် ခရုပတ်-ချုပ်ရိုးလျှပ်စစ် ပေါင်းစပ်သည် ကြီးမားသောအချင်း austenitic light-wall pipe အရွယ်အစား 14" မှ 30" အတွင်းရှိ Sch5S နှင့် Sch 10S တို့ကို နံရံများနှင့်/သို့မဟုတ် မြင့်မားသော နံရံများနှင့်အတူ ဂဟေဆော်ထားသည်။

ASTM A376 347- အပူချိန်မြင့်မားသောအသုံးချမှုများအတွက် ချောမွေ့မှုမရှိသော austenitic ပိုက်။

ASTM A813 347- မြင့်မားသောအပူချိန်နှင့် ယေဘူယျအဆိပ်သင့်သောအသုံးချမှုများအတွက် တစ်ခုတည်း-ချုပ်ရိုး၊ တစ်ခုတည်း သို့မဟုတ် နှစ်ဆဂဟေဆက်ထားသော austenitic ပိုက်။

ASTM A814 347- မြင့်မားသောအပူချိန်နှင့် ယေဘူယျအဆိပ်သင့်ခြင်းဝန်ဆောင်မှုအတွက် အအေးခံထားသော ဂဟေဆက်ထားသော austenitic ပိုက်။

347H Stainless Steel ပိုက်များ ဓာတုဖွဲ့စည်းမှု

Stainless Steel 347H Pipe စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများ

Stainless Steel 347H Pipes ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများ

347H Stainless Steel Pipe အတွက် ညီမျှသော အဆင့်များ

Amyloid alpha-synuclein (αS) စုစည်းမှုသည် ပါကင်ဆန်ရောဂါနှင့် အခြားသော အဆစ်ယောင်ရောဂါများဆိုင်ရာ လက္ခဏာတစ်ခုဖြစ်သည်။မကြာသေးမီက၊ အယ်လ်ဇိုင်းမားရောဂါနှင့် ဆက်စပ်လေ့ရှိသော tau ပရိုတင်းသည် αS ရောဂါဗေဒနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး αS ကြွယ်ဝသော ပါဝင်မှုများတွင် နေရာချထားသည်ကို တွေ့ရှိသော်လည်း ပရိုတင်းနှစ်ခု၏ ပေါင်းစည်းမှု၏ မော်လီကျူးယန္တရားမှာ မရှင်းလင်းသေးသော်လည်း၊αS အဆင့်သည် tau ကဲ့သို့သော အပြုသဘောဆောင်သော polypeptides ဖြင့် electrostatic complex condensation မှတဆင့် အရည် condensates အဖြစ်သို့ ကွဲသွားကြောင်း ဤနေရာတွင် ကျွန်ုပ်တို့ အစီရင်ခံပါသည်။polycations အတွက် αS ၏ ဆက်စပ်မှု နှင့် coagulation network ၏ valence depletion နှုန်းပေါ်မူတည်၍ သွေးခဲများသည် လျင်မြန်သော gelation သို့မဟုတ် coalescence ဖြစ်ကြပြီး နောက်တွင် နှေးကွေးသော amyloid များစုပုံလာကြသည်။အဆင့်မြင့် ဇီဝရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ နည်းပညာအစုံအလင်ကို ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အရည်-အရည် αS/Tau အဆင့် ခွဲခြားမှုကို လက္ခဏာရပ်ပြနိုင်ခဲ့ပြီး အရည်ပရိုတင်းကွန်ဒင်းဆိတ်တွင် ပရိုတင်းဓာတ်နှစ်မျိုးလုံးပါရှိသော ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းခြင်းဆီသို့ ဦးတည်သည့် အဓိကအချက်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်ခဲ့သည်။
အမြှေးပါးအခန်းများအပြင်၊ အရည်-အရည်အဆင့်ခွဲခြားခြင်း (LLPS) ဟုခေါ်သော ပရိုတင်းဓာတ်ကြွယ်ဝပြီး အရည်ကဲ့သို့သိပ်သည်းသောကိုယ်ခန္ဓာများဖွဲ့စည်းခြင်းဖြင့်လည်း ဆဲလ်များအတွင်း ပိုင်းခြားမှုကိုလည်း ရရှိနိုင်ပါသည်။ဤအမှုန်အမွှားများသည် အများအားဖြင့် ပရိုတင်း သို့မဟုတ် ပရိုတင်းများနှင့် RNA တို့ကြားတွင် များပြားလှသော ယာယီတုံ့ပြန်မှုများဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားပြီး သက်ရှိစနစ်အားလုံးနီးပါးတွင် လုပ်ဆောင်မှုအမျိုးမျိုးကို လုပ်ဆောင်ပေးသည်။LLP-capable proteins အများအပြားသည် သဘာဝတွင် အလွန်ချို့ယွင်းနေပြီး biomolecular condensates3,4,5 ၏ဖွဲ့စည်းမှုတွင် ရှုပ်ထွေးမှုနည်းပါးသော ပေါင်းစပ်မှုများကို ပြသသည်။များပြားလှသော စမ်းသပ်လေ့လာမှုများက ဤကွန်ဒင်းနိတ်များကဲ့သို့ အရည်ကဲ့သို့ ကွန်ဒင်းနိတ်များစုဖွဲ့သည့် ပရိုတင်းများ၏ လိုက်လျောညီထွေရှိသော၊ မကြာခဏ ဖရိုဖရဲနှင့် များပြားသော သဘောသဘာဝကို ဖော်ထုတ်နိုင်သော်လည်း၊ ဤကွန်ဒွန်နယ်များ၏ ကြီးထွားမှုနှင့် ရင့်ကျက်မှုကို ထိန်းချုပ်သည့် တိကျသော မော်လီကျူးသတ်မှတ်ခြင်းအကြောင်း အနည်းငယ်သာ သိရှိထားသော်လည်း၊ ပြည်နယ်။.
ပျက်ယွင်းနေသော ပရိုတိန်း-မောင်းနှင်သည့် LLPS နှင့် အစက်များကို အစိုင်အခဲဖွဲ့စည်းပုံများအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခြင်းတို့သည် မပျော်ဝင်နိုင်သော အဆိပ်အတောက်များစုပုံခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် ဆက်စပ်ဆဲလ်လမ်းကြောင်းများဖြစ်နိုင်သည်ဟူသော အယူအဆကို ထောက်ခံပါသည်။များစွာသော LLPS နှင့်ဆက်စပ်သော ပင်ကိုယ်စိတ်မမှန်သောပရိုတင်းများ (IDPs) များသည် မကြာခဏ မြင့်မားစွာအားသွင်းပြီး ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ရှိသော amyloid ပေါင်းစည်းမှုဖြစ်စဉ်မှတစ်ဆင့် အာရုံကြောများ ယိုယွင်းခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေပါသည်။အထူးသဖြင့်၊ FUS7 သို့မဟုတ် TDP-438 ကဲ့သို့သော ဇီဝမော်လီကျူး IDP ကွန်ဒွန်နိတ်များ သို့မဟုတ် hnRNPA19 ကဲ့သို့သော ရှုပ်ထွေးမှုနည်းပါးသော ဒိုမိန်းကြီးများပါရှိသော ပရိုတင်းများကို fluidization ဟုခေါ်သော လုပ်ငန်းစဉ်အားဖြင့် ဂျယ်လ်ကဲ့သို့ သို့မဟုတ် အစိုင်အခဲပုံစံများပင်အဖြစ်သို့ ပြသထားသည်။ထမင်း။အချိန်၏လုပ်ဆောင်မှုအဖြစ် သို့မဟုတ် အချို့သော ဘာသာပြန်ပြီးနောက် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများ သို့မဟုတ် ရောဂါဗေဒအရ သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများအတွက် တုံ့ပြန်မှုအဖြစ် (LSPT) သို့။
vivo တွင် LLPS နှင့် ဆက်စပ်နေသည့် နောက်ထပ် IDP သည် Tau သည် အယ်လ်ဇိုင်းမားရောဂါ 10 တွင် amyloid အစုလိုက်အပြုံလိုက်ပါဝင်နေသော microtubule-sociated disordered ပရိုတင်းတစ်မျိုးဖြစ်ပြီး မကြာသေးမီက Parkinson's disease (PD) နှင့် အခြားသော synaptic nuclear proteinopathies 11, 12, 13 တို့တွင်လည်း ဆက်စပ်နေပါသည်။Tau သည် အားကောင်းသော electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကြောင့် ဖြေရှင်းချက်/ cytoplasm မှ အလိုအလျောက် ကွဲသွားကြောင်းပြသခဲ့ပြီး၊ အီလက်ထရတ်စတီကျိတ် coacervates ဟုခေါ်သော tau-ကြွယ်ဝသော အမှုန်အမွှားများဖွဲ့စည်းခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ဤတိကျသောမဟုတ်သော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအမျိုးအစားသည် သဘာဝရှိ biomolecular condensates အများအပြား၏နောက်ကွယ်မှ မောင်းနှင်အားဖြစ်ကြောင်းကိုလည်း သတိပြုမိသည်။tauပရိုတင်းကိစ္စတွင်၊ ပရိုတင်း၏ဆန့်ကျင်ဘက်အားသွင်းထားသောဒေသများသည် ကွဲအက်ခြင်းဖြစ်စဉ်ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည့်၊ သို့မဟုတ် RNA ကဲ့သို့သော အနုတ်လက္ခဏာရှိသောပိုလီမာများနှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုမှတစ်ဆင့် ရှုပ်ထွေးသောပေါင်းစပ်မှုဖြင့် ရိုးရှင်းသောပေါင်းစပ်မှုဖြင့် electrostatic စုစည်းမှုကို ဖွဲ့စည်းနိုင်သည်။
မကြာသေးမီက၊ PD တွင်ပါ၀င်သော amyloid IDP နှင့် synucleinopathy17,18 ဟုခေါ်သော စုပေါင်းဆဲလ်များနှင့် တိရိစ္ဆာန်ပုံစံများ 19,20 တွင် အရည်ကဲ့သို့ အပြုအမူဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော PD နှင့် ဆက်စပ်နေသော အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများဆိုင်ရာ အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများဆိုင်ရာ α-synuclein (αS) ကို သရုပ်ပြခဲ့သည်။In vitro လေ့လာမှုများက αS သည် ယေဘုယျအားဖြင့် hydrophobic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများဖြင့် စုစည်းမှုအားဖြင့် LLPS ကို ခံစားရကြောင်း၊ ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် အထူးမြင့်မားသောပရိုတင်းပါဝင်မှုနှင့် ပုံမှန်အားဖြင့် ရှည်လျားသောပေါက်ဖွားချိန် ၁၉၊၂၁ လိုအပ်သော်လည်း၊vivo တွင်တွေ့ရှိရသော αS ပါဝင်သော condensates များကို ဤသို့မဟုတ် အခြားသော LLPS လုပ်ငန်းစဉ်များဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားခြင်း ရှိ၊ မရှိသည် အဓိက ဖြေရှင်းမရသေးသော ပြဿနာတစ်ခုအဖြစ် ရှိနေသေးသည်။အလားတူ၊ αS amyloid စုစည်းမှုကို PD နှင့် အခြားသော synucleinopathies များရှိ အာရုံကြောများတွင် တွေ့ရှိခဲ့သော်လည်း၊ ဤပရိုတိန်း၏ အလွန်အကျွံဖော်ပြမှုသည် သူ့ဘာသာသူ ဖြစ်စဉ်ကို အစပျိုးပုံမပေါ်သောကြောင့် αS သည် အတွင်းဆဲလ်အမိုင်အလွိုက်ပေါင်းစပ်ခြင်းကို ခံရသည့် ယန္တရားအတိအကျကို မရှင်းလင်းပါ။ဆဲလ်လူလာ αS amyloid စည်းဝေးပွဲများ ပြန်လည်ထူထောင်ရန်အတွက် အချို့သော ဆယ်လူလာတည်နေရာများ သို့မဟုတ် အဏုဇီဝပတ်ဝန်းကျင်များ လိုအပ်သည်ဟု အကြံပြုခြင်းဖြင့် ထပ်လောင်းဆယ်လူလာပျက်စီးမှုများ လိုအပ်ပါသည်။အထူးသဖြင့် စုစည်းမှုဖြစ်လွယ်သော ဆယ်လူလာပတ်ဝန်းကျင်တစ်ခုသည် ပရိုတင်းကွန်ဒင်းစင် 23 ၏အတွင်းပိုင်းဖြစ်နိုင်သည်။
စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ αS နှင့် tau တို့သည် Parkinson's disease နှင့် အခြားသော synucleinopathies 24,25 ရှိသောလူများတွင် လက္ခဏာရောဂါများပါ၀င်မှုတွင် တည်နေရာပြနိုင်သည်ကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများသည် ပရိုတိန်းနှစ်ခုကြားတွင် ပေါင်းစပ်ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာ ဆက်နွယ်မှုကို အစီရင်ခံတင်ပြခဲ့သည် 26,27 သည် αS နှင့် ပေါင်းစည်းမှုအကြား အလားအလာရှိသော ဆက်နွယ်မှုကို အကြံပြုထားသည်။ neurodegenerative ရောဂါများတွင် tau။နာမကျန်းဖြစ်ခြင်း။αS နှင့် tau တို့သည် ဗီတိုအတွင်း နှင့် vivo 28,29 တို့တွင် အချင်းချင်း၏ စုစည်းမှုကို အပြန်အလှန် မြှင့်တင်ရန် ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး အဆိုပါ ပရိုတင်းနှစ်မျိုးဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော ကွဲလွဲနေသော အစုအဝေးများကို synucleinopathies 30 လူနာများ၏ ဦးနှောက်တွင် လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။သို့သော်လည်း αS နှင့် tau အကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှု၏ မော်လီကျူးအခြေခံနှင့် ၎င်း၏ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်မှု ယန္တရားအကြောင်း အနည်းငယ်မျှ မသိရှိပါ။αS သည် αS ၏ မြင့်မားသောအနုတ်လက္ခဏာအားသွင်းထားသော C-terminal ဒေသနှင့် tau ၏ဗဟို proline-ကြွယ်ဝသောဒေသကြားရှိ electrostatic ဆွဲဆောင်မှုမှတဆင့် tau နှင့် အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်ကြောင်း အစီရင်ခံထားပါသည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ αS သည် tau ပရိုတင်း၏ရှေ့မှောက်တွင် electrostatic complex condensation မှတဆင့် အစက်အပြောက်များအဖြစ်သို့ ခွဲထုတ်နိုင်သည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ပြသသည်၊၊ ၎င်းသည် poly-L-lysine (pLK) ကဲ့သို့သော အခြားအပြုသဘောဆောင်သော polypeptides များနှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုနှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်ပြီး ဤလုပ်ငန်းစဉ်တွင်။αS သည် droplet network အတွက် scaffold မော်လီကျူးတစ်ခုအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။coacervate ကွန်ရက်တွင်ပါရှိသော ပရိုတင်းများ၏ အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှု၏ valent နှင့် strength ကွာခြားမှုများနှင့် ဆက်စပ်နေသော electrostatic αS coacervates များ၏ ရင့်ကျက်မှုဖြစ်စဉ်တွင် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိထားပါသည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် αS နှင့် tau amyloid ပရိုတင်းများကို တာရှည်ခံအရည် coacervates တွင် ပူးတွဲပေါင်းစည်းထားသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ထိုကဲ့သို့သော coacervates များတွင် ဤပရိုတိန်းနှစ်ခုကို ပေါင်းစည်းရန် အဓိကအချက်အချို့ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို အသေးစိတ်ဖော်ပြသည်၊၊ ၎င်းသည် ရောဂါအလိုက်ပါဝင်မှုများတွင် ပရိုတင်းနှစ်ခု၏ colocalization ကိုအခြေခံသည့် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော မော်လီကျူးယန္တရားတစ်ခုဖြစ်သည်။
αS တွင် အလွန်အမင်း anionic C-terminal အမြီးသည် ကြားနေ pH (ပုံ 1a) တွင်ရှိပြီး polycationic disordered polypeptide မော်လီကျူးများနှင့်အတူ electrostatic complexes များ၏ ငွေ့ရည်ဖွဲ့မှုမှတဆင့် LLPS ကို ခံရနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယူဆပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် 100-residue poly-L-lysine (pLK) ကို ၎င်း၏ မူလပုံစံမော်လီကျူးအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး ၎င်း၏ pH 32 တွင် အပြုသဘောဆောင်သော အားသွင်းပြီး ဖရိုဖရဲဖြစ်နေသော ပေါ်လီမာသဘာ၀ဖြစ်သည်။ ပထမဦးစွာ၊ pLK သည် Solution NMR spectroscopy မှတဆင့် αS ၏ Ct ဒိုမိန်းနှင့် ဓါတ်ပြုကြောင်း အတည်ပြုပါသည်။ (ပုံ 1b) 13C/15N-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS ကို အသုံးပြု၍ αS:pLK အံသွားအချိုးများ တိုးလာနေပါသည်။αS ၏ Ct-domain နှင့် pLK ၏ အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှုသည် ဓာတုပြောင်းလဲမှု၏ အနှောင့်အယှက်များနှင့် ပရိုတင်း၏ ဤဒေသရှိ အထွတ်အထိပ်ပြင်းထန်မှု လျော့နည်းသွားခြင်းတို့ဖြင့် ထင်ရှားသည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် αS နှင့် pLK ကို အနီးစပ်ဆုံး αS အာရုံစူးစိုက်မှုဖြင့် ရောနှောသောအခါ။polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (ပုံမှန် LLPS ကြားခံ- 10 mM HEPES pH 7.4၊ 100 mM NaCl၊ 15% PEG-8) တွင် 5-25 µM) ကျွန်ုပ်တို့သည် ပရိုတိန်းဖွဲ့စည်းမှု ကျယ်ပြန့်သော နယ်ပယ်ကို ဖြတ်၍ ချက်ချင်းဆိုသလို၊ .အမှုန်အမွှားများကို fluorescence (WF) နှင့် bright-field (BF) microscopy (ပုံ. 1c) ကို အသုံးပြု၍ လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။ပါဝင်သော 1-5 µm အမှုန်အမွှားများ (1 µM AlexaFluor488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS၊ AF488-αS) ပါ၀င်သော အမှုန်အမွှားများသည် ၎င်းတို့၏လျှပ်စစ်ဓာတ်ဂုဏ်သတ္တိများကို 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) နှင့် ၎င်း၏ အာရုံခံနိုင်ရည်မှ ဆင်းသက်လာနိုင်သည်။ NaCl အာရုံစူးစိုက်မှုတိုးလာသည် (ပုံ။ 1c)။αS/pLK electrostatic complex ၏ coacervates ၏ အရည်သဘာ၀ကို ၎င်းတို့၏ မီလီစက္ကန့်အတွင်း ပေါင်းစပ်နိုင်မှု (ပုံ။ 1d) ဖြင့် ပြသထားသည်။turbidimetry ကိုအသုံးပြု၍ ဤအခြေအနေများအောက်တွင် အစက်အစက်များဖွဲ့စည်းခြင်းကို တိုင်းတာခဲ့ပြီး ၎င်း၏တည်ငြိမ်မှုနှင့်ဆက်စပ်သော အဓိကအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု၏ electrostatic သဘောသဘာဝကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး LLPS လုပ်ငန်းစဉ်အပေါ် အမျိုးမျိုးသောပေါ်လီမာအချိုးအစားများ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည် (ပုံ။ 1f)။အစက်အပြောက်များဖွဲ့စည်းခြင်းကို ပိုလီမာအချိုးအစားများစွာဖြင့် သတိပြုမိသော်လည်း pLK သည် αS ထက်ကျော်လွန်သောအခါ လုပ်ငန်းစဉ်သည် အလွန်ကောင်းမွန်သည်။LLP များကို ဓာတုဗေဒနည်းအရ ကွဲပြားသော ရွှေ့ပြောင်းနိုင်သော အေးဂျင့် dextran-70 (70 kDa) သို့မဟုတ် ဖန်ဆလိုက်အစက်များ၊ အမျိုးမျိုးသော ပစ္စည်းများ၏ မိုက်ခရိုပလိတ်ရေတွင်းများ၊ Eppendorf သို့မဟုတ် quartz သွေးကြောမျှင်များ အပါအဝင် နမူနာဖော်မတ်များကို အသုံးပြု၍လည်း တွေ့ရှိရပါသည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်အသုံးပြုသည့် WT-αS နှင့် ΔCt-αS မျိုးကွဲများရှိ မတူညီသောပရိုတင်းဒေသများ၏ သရုပ်ဖော်ပုံ။amphipathic N-terminal domain၊ hydrophobic amyloid-forming (NAC) ဒေသ၊ နှင့် negatively charged C-terminal domain ကို အပြာ၊ လိမ္မော်၊ နှင့် အနီရောင် အသီးသီး ပြထားသည်။WT-αS ၏ Net Charge Per Residual (NCPR) မြေပုံကို ပြထားသည်။b macromolecular အစုအဝေးများမရှိခြင်း၌ αS/pLK အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို NMR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။pLK အာရုံစူးစိုက်မှု တိုးလာသည်နှင့်အမျှ (αS:pLK အံသွားအချိုး 1:0.5၊ 1:1.5၊ နှင့် 1:10 တို့ကို အစိမ်းဖျော့ဖျော့၊ အစိမ်းနှင့် အစိမ်းနုရောင်တို့ဖြင့် ပြသသည်)။c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) ကို 25 µM (1 µM AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS သို့မဟုတ် WF ပုံရိပ်အတွက် Atto647N-တံဆိပ်တပ်ထားသော pLK) တွင် LLPS ကြားခံ (အပေါ်ပိုင်း) သို့မဟုတ် 500 mM NaCl (အောက်ခြေဘယ်ဘက် 10) တွင် ဖြည့်စွက် % 1,6-hexanediol (1,6-HD; အောက်ခြေညာဘက်)။စကေးဘား = 20 µm ။d 25 μM တွင် αS/pLK (molar ratio 1:10) ၏ BF အမှုန်အမွှားပေါင်းစပ်မှု၏ ကိုယ်စားပြု အဏုကြည့်ပုံရိပ်များ၊မြှားများသည် 200 ms အတွင်း တစ်စက် (အနီနှင့် အဝါရောင် မြှားများ) ပေါင်းစပ်ခြင်းကို ညွှန်ပြသည်။စကေးဘား = 20 µm ။e 500 mM NaCl ၏ 500 mM NaCl မတိုင်မီနှင့် ပြီးနောက် LLPS ကြားခံတွင် αS/pLK စုစည်းမှု (350 nm) တွင် အလင်းဖြန့်ကျက်ခြင်း သို့မဟုတ် 25 µM αS တွင် 10% 1,6-HD (N = 3 နမူနာပုံတူများ၊ ပျမ်းမျှနှင့် စံသွေဖည်မှုကိုလည်း ဖော်ပြသည်)။f BF ပုံ (အပေါ်ပိုင်း) နှင့် αS/pLK ပေါင်းစပ်မှု 25 μM αS ၏ 350 nm အလင်းဖြာဖြာ (အပေါ်ပိုင်း) နှင့် αS:pLK အံပွားအချိုး (N = 3 နမူနာပုံတူများ၊ ပျမ်းမျှနှင့် စံသွေဖည်မှုကိုလည်း ညွှန်ပြသည်)။စကေးဘား = 10 µm ။ပုံတစ်ပုံရှိ စကေးဘားသည် အကန့်တစ်ခုရှိ ပုံအားလုံး၏ အတိုင်းအတာကို ညွှန်ပြသည်။ဒေတာအကြမ်းကို ဒေတာအကြမ်းဖိုင်များပုံစံဖြင့် ပေးပါသည်။
αS/pLK electrostatic complex condensation နှင့် tau/RNA condensate ၏ client မော်လီကျူးအဖြစ် αS ၏ ယခင်လေ့လာတွေ့ရှိချက်များအပေါ် အခြေခံ၍ tau31 နှင့် တိုက်ရိုက်အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုမှတစ်ဆင့် αS နှင့် tau တို့သည် RNA မရှိသည့်အချိန်တွင် ဓာတုပစ္စည်းနှင့် ပေါင်းစပ်နိုင်သည်ဟု ယူဆပါသည်။ ငွေ့ရည်ဖွဲ့ခြင်း။electrostatic complexes များမှတဆင့် αS သည် αS/Tau coacervates အတွင်းရှိ scaffold ပရိုတိန်းဖြစ်သည် (ပုံ 2e တွင် tau charge distribution ကိုကြည့်ပါ)။LLPS ကြားခံတွင် 10 μM αS နှင့် 10 μM Tau441 (1 μM AF488-αS နှင့် 1 μM Atto647N-Tau အသီးသီးပါရှိသော) ကို LLPS ကြားခံတွင် ရောနှောလိုက်သောအခါ၊ ၎င်းတို့သည် ပရိုတိန်းနှစ်မျိုးလုံးပါရှိသော ပရိုတိန်းအစုအဝေးများကို WF မိုက်ခရိုစကေးရှင်းဖြင့် အလွယ်တကူ ဖွဲ့စည်းနိုင်သည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။(ပုံ။ 2a)။အစက်များအတွင်းရှိ ပရိုတိန်းနှစ်ခု၏ colocalization ကို confocal (CF) microscopy (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 1a) ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။dextran-70 ကို ပေါင်းစည်းအေးဂျင့် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 1c) အဖြစ် အသုံးပြုသောအခါတွင် အလားတူအပြုအမူကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။FITC တံဆိပ်တပ်ထားသော PEG သို့မဟုတ် dextran တို့ကို အသုံးပြု၍ လူစုလူဝေးဖြစ်စေသော အေးဂျင့်နှစ်ခုလုံးကို နမူနာများပေါ်တွင် အညီအမျှ ခွဲဝေပေးခဲ့ပြီး ခွဲခြားထားခြင်း သို့မဟုတ် ပေါင်းစည်းခြင်းတို့ကို မပြသပါ (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 1d) ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ယင်းအစား၊ PEG သည် အခြားသော LLP စနစ် 33,34 တွင်တွေ့မြင်ရသည့်အတိုင်း ပိုမိုတည်ငြိမ်သော လူစုလူဝေးဖြစ်စေသော အေးဂျင့်ဖြစ်သောကြောင့် ဤစနစ်တွင် ၎င်းတို့သည် အဆင့်ခွဲခြားခြင်းကို macromolecular လူစုလူဝေးပြုလုပ်ခြင်းအကျိုးသက်ရောက်မှုများမှတစ်ဆင့် မြှင့်တင်ပေးကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ဤပရိုတင်းဓာတ်ကြွယ်ဝသောအမှုန်အမွှားများသည် NaCl (1 M) တွင် အာရုံခံစားနိုင်သော်လည်း ၎င်းတို့၏လျှပ်စစ်ဓာတ်ဂုဏ်သတ္တိများကို အတည်ပြုခြင်း 1.6-HD (10% v/v) သို့မဟုတ် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2a၊ b)။BF အဏုကြည့်မှန်ဘီလူး (ပုံ. 2b) ကို အသုံးပြု၍ မီလီစက္ကန့် ပေါင်းစပ်ထားသော အမှုန်အမွှားဖြစ်ရပ်များကို စောင့်ကြည့်ခြင်းဖြင့် ၎င်းတို့၏ အရည်အပြုအမူကို အတည်ပြုခဲ့သည်။
αS/Tau441 ၏ အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးရုပ်ပုံများသည် LLPS ကြားခံတွင် (ပရိုတင်းတစ်ခုစီ၏ 10 μM၊ AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS ၏ 0.5 μM နှင့် Atto647N တံဆိပ်တပ်ထားသော Tau441) တွင် ပါဝင်သည်။b αS/Tau441 အစက်အပြောက် ပေါင်းစပ်ဖြစ်ရပ်များ (ပရိုတင်းတစ်ခုစီအတွက် 10 μM) ၏ ကိုယ်စားပြု ကွဲပြားခြားနားသော နှောင့်ယှက်မှု ဆန့်ကျင်ဘက် (DIC) ပုံများ။c မရှိခြင်း (ဘယ်) သို့မဟုတ် 50 µM αS ရှိသော Tau441 LLPS (0–15 µM) ၏ အလင်းရောင် (350 nm) တွင် (350 nm) တွင် အလင်းကြဲဖြန့်မှုအပေါ် အခြေခံသည့် အဆင့်ပြမြေပုံ။ပူနွေးသောအရောင်များသည် ပိုမိုကွဲအက်ခြင်းကို ညွှန်ပြသည်။d αS အာရုံစူးစိုက်မှု တိုးလာခြင်းဖြင့် αS/Tau441 LLPS နမူနာများကို အလင်းဖြန့်ကျက်ခြင်း (Tau441 တွင် 5 µM၊ N = ညွှန်ပြထားသည့်အတိုင်း 2–3 နမူနာ ထပ်ခါတလဲလဲများ)။e အချို့သော tauပရိုတင်းမျိုးကွဲများနှင့် ဤလေ့လာမှုတွင်အသုံးပြုသည့် ပရိုတင်း၏မတူညီသောဒေသများ၏ သရုပ်ဖော်ပုံ- အနုတ်လက္ခဏာပြသော N-terminal ဒိုမိန်း (အနီရောင်)၊ ပရိုလိုင်းကြွယ်ဝသောဒေသ (အပြာရောင်)၊ microtubule-binding domain (MTBD၊ လိမ္မော်ရောင်ဖြင့် အသားပေးထားသည့်) နှင့် amyloid-forming pair ခရုပတ်။MTBD (မီးခိုးရောင်) အတွင်းတွင်ရှိသော အမျှင်တန်းဒေသများ (PHF)။Tau441 ၏ Net Charge Per Residue (NCPR) မြေပုံကို ပြထားသည်။f 1 µM AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS နှင့် Atto647N တံဆိပ်တပ်ထားသည့် ΔNt- ကိုအသုံးပြု၍ ΔNt-Tau (အပေါ်၊ ပရိုတိန်းတစ်ခုလျှင် 10 µM) သို့မဟုတ် K18 (အောက်ခြေ၊ µM per 50) (အောက်ခြေ၊ µM) ) ) ) LLPS သို့မဟုတ် K18 ကြားခံတွင်ထည့်ထားသော WF ၏မိုက်ခရိုဂရပ်များ။ပုံတစ်ပုံရှိ စကေးဘားများသည် အကန့်တစ်ခုရှိ ပုံအားလုံး၏စကေးကို ကိုယ်စားပြုသည် (အကန့် a၊ b နှင့် f အတွက် 20 µm)။အကန့် c နှင့် d အတွက် အကြမ်းထည်ဒေတာကို ဒေတာအကြမ်းဖိုင်များအဖြစ် ပေးပါသည်။
ဤ LLPS လုပ်ငန်းစဉ်တွင် αS ၏အခန်းကဏ္ဍကိုစမ်းသပ်ရန်အတွက် NaCl (ပုံ 2c) ကိုအသုံးပြု၍ nephelometry ဖြင့် droplet တည်ငြိမ်မှုအပေါ် αS ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဦးစွာစုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။αS ပါ၀င်သောနမူနာများတွင် ဆားပါဝင်မှု ပိုများလေ၊ ဤ LLPS စနစ်တွင် αS ၏ တည်ငြိမ်မှုကို ညွှန်ပြသော အလင်းဖြန့်ကျက်တန်ဖိုးများ (350 nm) ပိုများလေဖြစ်သည်။αS အာရုံစူးစိုက်မှု (ထို့ကြောင့် αS:Tau441 အချိုး) ကို အနီးစပ်ဆုံး တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် အလားတူအကျိုးသက်ရောက်မှုကို သတိပြုနိုင်သည်။tau အာရုံစူးစိုက်မှု (5 µM) (ပုံ. 2d) နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် 10 ဆတိုးလာသည်။αS သည် coacervates တွင် scaffold ပရိုတိန်းဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြရန်၊ ΔNt-Tau ဟုခေါ်သော အနှုတ်လက္ခဏာဆောင်သော LLPS-ပြတ်တောက်သော Tau mutant ၏အပြုအမူကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ယခင်က အစီရင်ခံထားသည့်အတိုင်း ΔNt-Tau ကိုယ်တိုင် LLPS (ပုံ 2f နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 2d) ကို မလုပ်ဆောင်ခဲ့ကြောင်း WF အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းနှင့် nephelometry မှ အတည်ပြုခဲ့သည်။ သို့သော်၊ αS ကို ဖြတ်တောက်ထားသော Tau အမျိုးအစား၏ ကွဲလွဲသောဖြေရှင်းချက်သို့ ပေါင်းထည့်လိုက်သောအခါ၊ LLPS လုပ်ငန်းစဉ်သည် လုံးဝဖြစ်သည် အလားတူအခြေအနေများနှင့် ပရိုတင်းပါဝင်မှုအောက်တွင် Tau နှင့် αS ၏ အရွယ်အစားပြည့်ဖြေရှင်းချက်များ၏ အစက်အပြောက်သိပ်သည်းဆနှင့် နီးစပ်သော droplet density ဖြင့် ပြန်လည်ရယူသည်။ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို macromolecular နည်းပါးသောအခြေအနေများတွင်လည်း စောင့်ကြည့်နိုင်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2c)။C-terminal αS ဒေသ၏အခန်းကဏ္ဍ၊ သို့သော်၎င်း၏အရှည်တစ်ခုလုံးမဟုတ်ပါ၊ LLPS လုပ်ငန်းစဉ်တွင် (ΔCt- ၏အကြွင်းအကျန်များမရှိသော 104–140 (ပုံ 1a)) ကို C-terminal ဖြတ်ထားသော αS မူကွဲကို အသုံးပြု၍ အစက်အစက်ဖြစ်ပေါ်ခြင်းကို ဟန့်တားခြင်းဖြင့် သရုပ်ပြခဲ့သည်။ αS) ပရိုတင်း (ပုံ။ 2f နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 2d)။αS နှင့် ΔNt-Tau ၏ colocalization ကို confocal fluorescence microscopy (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 1b) ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။
Tau441 နှင့် αS ကြားရှိ LLPS ယန္တရားအား ထပ်မံစမ်းသပ်ရန်အတွက် Tau ဗားရှင်းကို ထပ်မံအသုံးပြုခဲ့သည်၊ အတိအကျဆိုရသော် ၎င်းတွင် တွဲထားသော helical filament core (PHF) အပိုင်းအစကို microtubule-binding domain (MTBD) ရှိ၊ K18 အပိုင်းအစ (ပုံ 2e ကိုကြည့်ပါ)။αS သည် microtubule-binding ဒိုမိန်း၏ ရှေ့ဆင့်နောက်ဆက်တွဲတစ်ခုတွင် ပရိုလိုင်းကြွယ်ဝသောဒိုမိန်းတွင်ရှိသော tau ပရိုတင်းနှင့် ဦးစားပေးအားဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားကြောင်း မကြာသေးမီက အစီရင်ခံတင်ပြခဲ့သည် ။သို့သော်၊ PHF ဒေသတွင် အပြုသဘောဆောင်သော အကြွင်းအကျန်များ (ပုံ 2e ကိုကြည့်ပါ) ၊ အထူးသဖြင့် lysine (15% အကြွင်းအကျန်များ) သည် αS/Tau complex ၏ ငွေ့ရည်ဖွဲ့မှုကိုလည်း ပံ့ပိုးပေးနိုင်ခြင်းရှိမရှိ စမ်းသပ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့ကို လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။K18 တစ်ခုတည်းသည် စမ်းသပ်ထားသော အခြေအနေများအောက်တွင် ပြင်းအား 100 μM အထိ LLPS ကို မဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (LLPS ကြားခံ 15% PEG သို့မဟုတ် 20% dextran) (ပုံ 2f) (ပုံ 2f)။သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့ 50 µM αS ကို 50 µM K18 သို့ ထည့်သောအခါ၊ K18 နှင့် αS ပါရှိသော ပရိုတင်းအစက်များ လျင်မြန်စွာဖွဲ့စည်းခြင်းကို nephelometry (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2d) နှင့် WF အဏုစကုပ် (ပုံ. 2f) ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ΔCt-αS သည် K18 ၏ LLPS အပြုအမူကို ပြန်မရနိုင်တော့ပါ။αS/K18 ပေါင်းစည်းမှုသည် αS/ΔNt-Tau သို့မဟုတ် αS/Tau441 နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် LLPS ကိုသွေးဆောင်ရန်အတွက် အနည်းငယ်ပိုမိုမြင့်မားသောပရိုတင်းဓာတ်ပါဝင်မှုကို လိုအပ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့သတိပြုမိပါသည်။၎င်းသည် ယခင်က 31 တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း microtubule-binding ဒိုမိန်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပရိုလိုင်းကြွယ်ဝသော Tau ဒိုမိန်းနှင့် αS C-terminal ဒေသ၏ အားကောင်းသည့် အပြန်အလှန်သက်ရောက်မှုနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။
ΔNt-Tau သည် αS မရှိသည့်အတွက် LLPS မလုပ်ဆောင်နိုင်သောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Tau (isotype၊ Tau441/Tau441) ဖြင့် LLPS စနစ်များတွင် ၎င်း၏ရိုးရှင်းမှုပေးထားသည့် αS/Tau LLPS ကိုဖော်ပြရန်အတွက် စံနမူနာအဖြစ် ဤ Tau မျိုးကွဲကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ရှုပ်ထွေးသော (heterotypic၊ αS/Tau441) စုစည်းမှုလုပ်ငန်းစဉ်များ။ကျွန်ုပ်တို့သည် αS စုစည်းမှုအဆင့် (နို့ဆီအဆင့်ပရိုတင်း၊ fαS၊c) ၏တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအနေဖြင့် αS/Tau နှင့် αS/ΔNt-Tau စနစ်များတွင် centrifugation နှင့် dispersed အဆင့် SDS-PAGE ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (2e ကိုကြည့်ပါ) နှင့် အလွန်ဆင်တူသောတန်ဖိုးများကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ပရိုတင်းအားလုံးအတွက် တူညီသောအာရုံစူးစိုက်မှု။အထူးသဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် αS/Tau နှင့် αS/ΔNt-Tau အတွက် fαS၊c 84 ± 2% နှင့် 79 ± 7% အသီးသီးရရှိထားပြီး αS နှင့် tau အကြား heterotypic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် tau မော်လီကျူးများကြား အပြန်အလှန်ဆက်ဆံမှုထက် သာလွန်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။အကြား။
အမျိုးမျိုးသော polycations များနှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုနှင့် αS kinetics ပေါ်ရှိ ငွေ့ရည်ဖွဲ့မှုဖြစ်စဉ်၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို photobleaching (FRAP) နည်းလမ်းပြီးနောက် fluorescence recovery ဖြင့် ပထမဆုံးလေ့လာခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် αS/Tau441၊ αS/ΔNt-Tau နှင့် αS/pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS နှင့် 100 μM Tau441 သို့မဟုတ် ΔNt-Tau သို့မဟုတ် 1 mM pLK) တို့ကို စမ်းသပ်ခဲ့သည်။နမူနာအစိတ်အပိုင်းများကို ရောစပ်ပြီးနောက် ပထမမိနစ် 30 အတွင်း ဒေတာကို ရရှိခဲ့သည်။ကိုယ်စားလှယ် FRAP ရုပ်ပုံများ (ပုံ 3a၊ αS/Tau441 ငွေ့ရည်ဖွဲ့မှု) နှင့် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ အချိန်သင်တန်း မျဉ်းကွေးများ (ပုံ 3b၊ နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 3) မှ αS kinetics သည် Tau441 coacervates နှင့် အလွန်ဆင်တူကြောင်း တွေ့နိုင်ပါသည်။နှင့် ΔNt-Tau သည် pLK ဖြင့် ပိုမြန်သည်။FRAP (Kang et al. 35 မှဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) အတွင်းရှိ αS အတွက် တွက်ချက်ထားသော ပျံ့နှံ့မှုကိန်းဂဏန်းများသည် D = 0.013 ± 0.009 µm2/s နှင့် D = 0.026 ± 0.008 µm2/s နှင့် αS/Δ-Tau4/s အတွက် αS/ စနစ်။pLK၊ Tau နှင့် D = 0.18 ± 0.04 µm2/s အသီးသီး (ပုံ။ 3c)။သို့သော်၊ ပြန့်ကျဲနေသောအဆင့်ရှိ ပျံ့နှံ့မှုကိန်းဂဏန်း αS သည် Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ 3 ကိုကြည့်ပါ) တွင် တူညီသောအခြေအနေများအောက်တွင် (LLPS ကြားခံများ) မှသတ်မှတ်ထားသည့်အတိုင်း နို့ဆီအဆင့်များအားလုံးထက် ပြင်းအားအမြောက်အများ ပိုများနေပါသည်။ (D = 8 ± 4 µm2/s)။ထို့ကြောင့်၊ coacervates အားလုံးသည် tau အဆင့်နှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့ဖွဲ့စည်းပြီးနောက် ပထမနာရီဝက်အတွင်း အရည်ကဲ့သို့ ဂုဏ်သတ္တိများကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သော်လည်း၊ ပြန့်ကျဲနေသောအဆင့်ရှိ ပရိုတင်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက αS ဘာသာပြန်ခြင်း၏ kinetics သည် ပြန့်ကျဲနေသောအဆင့်ရှိ ပရိုတင်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာ လျော့ကျသွားပါသည်။pLK condensate တွင်ပိုမိုမြန်ဆန်သော kinetics။
a–c FRAP သည် electrostatic coacervates တွင် αS ဒိုင်နနမစ် (2% AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS) ၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။triplicate တွင် αS/Tau441 FRAP စစ်ဆေးမှုများ၏ ကိုယ်စားလှယ်ရုပ်ပုံများကို (a) တွင်ပြသထားပြီး အနီရောင်စက်ဝိုင်းများက အရောင်ဖျော့ထားသောဧရိယာများကိုဖော်ပြသည်။စကေးဘားသည် 5 µm ဖြစ်သည်။b ပျမ်းမျှ FRAP မျဉ်းကွေးများနှင့် (ဂ) 100 µM αS နှင့် Tau441 (အနီရောင်) သို့မဟုတ် ΔNt-Tau (အပြာ) သို့မဟုတ် pLK (အစိမ်းရောင်) ကိုအသုံးပြု၍ စမ်းသပ်ချက်သုံးခုမှ မတူညီသော အစက်အစက် 5–6 (N) အတွက် ပျမ်းမျှ FRAP မျဉ်းကွေးများနှင့် (ဂ) တွက်ချက်ထားသော diffusion coefficients (D) LLPS ၏အာရုံစူးစိုက်မှုဆယ်ဆ။FRAP မျဉ်းကွေး၏ စံသွေဖည်မှုကို အရိပ်အရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။နှိုင်းယှဉ်ရန်အတွက်၊ ပြန့်ကျဲနေသောအဆင့်ရှိ diffusion coefficient αS ကို fluorescence correlation spectroscopy (FCS) ကို အသုံးပြု၍ triplicate ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (နောက်ထပ် ပုံ 3 နှင့် နည်းလမ်းများကို ကြည့်ပါ)။d မည်သည့် polycation (အနက်ရောင်) သို့မဟုတ် 100 μM Tau441 (အနီရောင်) သို့မဟုတ် ΔNt-Tau (အပြာ) သို့မဟုတ် 1 mM pLK (အစိမ်းရောင်) မပါဘဲ LLPS ကြားခံတွင် 100 μM TEMPOL-122-αS ၏ဆက်တိုက် X-band EPR ရောင်စဉ်။ထည့်သွင်းမှုတွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုများ အများဆုံးဖြစ်ပေါ်သည့် အားကောင်းသော အကွက်မျဉ်းများကို ချဲ့ထွင်ပြသထားသည်။LLPS (PEG မရှိခြင်း) တွင် အမျိုးမျိုးသော polycations များဖြင့် 50 μM TEMPOL-122-αS ၏ချည်နှောင်ထားသောမျဉ်းကွေးများ။ပုံမှန်လုပ်ထားသည့် EPR spectrum ၏ band II (IIII/III) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက band III ၏ ပမာဏ လျော့နည်းသွားခြင်းသည် Tau441 (အနီရောင်)၊ ΔNt-Tau (အပြာ) နှင့် pLK (အစိမ်းရောင်) ၏ အံသွားအချိုးများကို တိုးလာစေရန် ပြသထားသည်။မျဉ်းကွေးတစ်ခုစီရှိ မျဉ်းကွေးတစ်ခုစီရှိ တူညီပြီး အမှီအခိုကင်းသော ချိတ်ဆိုဒ်များပါရှိသော ကြမ်းတမ်းသော စည်းနှောင်မှုပုံစံကို အသုံးပြုကာ ရောင်စုံလိုင်းများသည် ဒေတာနှင့် အံဝင်ခွင်ကျရှိစေသည်။ဒေတာအကြမ်းကို ဒေတာအကြမ်းဖိုင်များပုံစံဖြင့် ပေးပါသည်။
ဖြည့်စွက်အနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ညွှန်ကြားထားသော လှည့်ပတ်တံဆိပ်ကပ်ခြင်း (SDSL) နှင့် စဉ်ဆက်မပြတ် အီလက်ထရွန် ပါရာသံလိုက်ပဲ့တင်ရိုက်ခတ်မှု (CW-EPR) ကို အသုံးပြု၍ အမျိုးမျိုးသော coacervates များတွင် αS ၏ ဒိုင်းနမစ်များကို စုံစမ်းလေ့လာခဲ့ပါသည်။ဤနည်းလမ်းသည် IDP ၏ ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်နှင့် ဒိုင်းနမစ်များကို လက်တွေ့ဆန်သော ကျန်နေသော resolution36,37,38 ဖြင့် အစီရင်ခံရာတွင် အလွန်အသုံးဝင်ကြောင်း သက်သေပြထားပါသည်။ဤအဆုံးသတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Cys mutants တစ်ခုတည်းတွင် cysteine ​​အကြွင်းအကျန်များကို တည်ဆောက်ခဲ့ပြီး 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) လှည့်ဖျားမှုဆိုင်ရာ စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။Maleimide ၏ ဆင်းသက်လာမှု သည် ၎င်းတို့ကို အညွှန်းတပ်သည်။အထူးသဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အနေအထား 122 သို့မဟုတ် 24 αS (TEMPOL-122-αS နှင့် TEMPOL-24-αS) တွင် TEMPOL probes များကို ထည့်သွင်းထားသည်။ပထမကိစ္စတွင်၊ polycations နှင့်အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုတွင်ပါ ၀ င်သည့်ပရိုတင်း၏ C-terminal ဒေသကိုကျွန်ုပ်တို့ပစ်မှတ်ထားသည်။ယင်းအစား၊ position 24 သည် condensate အတွင်းရှိ ပရိုတိန်းများ၏ အလုံးစုံသော ဒိုင်းနမစ်များအကြောင်း အချက်အလက်များကို ပေးနိုင်ပါသည်။ဖြစ်ရပ်နှစ်ခုစလုံးတွင်၊ ပြန့်ကျဲနေသောအဆင့်၏ပရိုတိန်းများအတွက်ရရှိသော EPR အချက်ပြမှုများသည် လျင်မြန်စွာရွေ့လျားနေသောအခြေအနေရှိ နိုက်ထရိုဆိုက်အစွန်းရောက်များနှင့် သက်ဆိုင်ပါသည်။tau သို့မဟုတ် pLK (100 μM TEMPOL-αS၊ Tau441 သို့မဟုတ် ΔNt-Tau အချိုးအစား 1:1 သို့မဟုတ် pLK အချိုး 1:10) တွင် အဆင့်ခွဲခြားပြီးနောက်) တွင် ဆွေမျိုးအထွတ်အထိပ်ပြင်းထန်မှု တိုးလာသည်ကို တွေ့ရှိရသည်။ αS ၏ EPR ရောင်စဉ်။အစက်အပြောက်များတွင် αS ပြန်လည်ဦးတည်ခြင်း kinetics လျော့နည်းသွားခြင်းကို ညွှန်ပြသော ဆုံးရှုံးမှုမျဉ်းသည် ပျော့ပျောင်းသောအဆင့်ရှိ ပရိုတင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်သည် (ပုံ။ 3d၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4a)။ဤပြောင်းလဲမှုများသည် အနေအထား 122 တွင် ပိုမိုသိသာထင်ရှားပါသည်။ အနေအထား 24 တွင် pLK ၏ပါဝင်မှုမှာ probe ၏ kinetics ကို မထိခိုက်စေဘဲ အနေအထား 122 တွင် ရောင်စဉ်တန်းမျဉ်းပုံသဏ္ဍာန်သည် သိသိသာသာ ပြောင်းလဲသွားသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 4a)။ကျွန်ုပ်တို့သည် ပုံမှန်အားဖြင့် isotropic မော်ဒယ် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5a) ကို အသုံးပြု၍ αS/polycation စနစ်နှစ်ခု၏ အနေအထား 122 တွင် ရောင်စဉ်တန်းကို ပုံစံပြရန် ကြိုးပမ်းသောအခါ၊ လှည့်ပတ်တံဆိပ်တပ်ထားသော IDP38,39 ၏ ဒိုင်းနမစ်ကို ဖော်ပြရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် စမ်းသပ်ဆဲရောင်စဉ်ကို ပြန်လည်တည်ဆောက်၍မရပါ။.24 လှည့်သွားသည့် ဆန့်ကျင်ဘက်အနေအထား၏ ရောင်စဉ်တန်းတူခြင်း (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 5a)။၎င်းသည် polycations များရှေ့မှောက်တွင် αS ၏ C-terminal ဒေသ၏ spin configurations နေရာလွတ်တွင် ဦးစားပေးရာထူးများရှိကြောင်း အကြံပြုထားသည်။စမ်းသပ် EPR အခြေအနေများအောက်တွင် αS ၏ အပိုင်းအစကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသောအခါ (84 ± 2%, 79 ± 7%, နှင့် αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, နှင့် αS/pLK အတွက် 47 ± 4% အသီးသီး- နောက်ဆက်တွဲကို ကြည့်ပါ၊ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ ပုံ 2e)၊ EPR နည်းလမ်းဖြင့် တွေ့ရှိထားသော ကျယ်ပြန့်မှုသည် အဓိကအားဖြင့် αS ၏ C-terminal ဒေသ၏ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကို ထင်ဟပ်စေသည် (နို့ဆီအဆင့်တွင် အမျိုးမျိုးသော polycations နှင့် TEMPOL-122- ကိုအသုံးပြုသောအခါ အဓိကပြောင်းလဲမှုဖြစ်သည်၊ αS) နှင့် ပရိုတင်းငွေ့ရည်ဖွဲ့ခြင်း မဟုတ်ပါ။စူးစမ်းလေ့လာမှုတွင် microviscosity တိုးလာသည်ကို တွေ့ရသည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ LLPS မှလွဲ၍ အခြားအခြေအနေများအောက်တွင် ပရိုတင်း၏ EPR spectrum သည် 1 M NaCl ကို အရောအနှောသို့ ထည့်လိုက်သောအခါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4b) တွင် လုံး၀ ပြန်လည်ရောက်ရှိသွားပါသည်။ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် CW-EPR မှတွေ့ရှိထားသောပြောင်းလဲမှုများသည် အဓိကအားဖြင့် αS ၏ C-terminal ဒေသ၏အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအား ပေါင်းစပ်ထားသောအဆင့်ရှိ polycations အမျိုးမျိုးဖြင့် ထင်ဟပ်နေပြီး ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် Tau ထက် pLK နှင့် ပိုမိုအားကောင်းပုံပေါ်ပါသည်။
coacervate အတွင်းရှိ ပရိုတင်းများအကြောင်း ပိုမိုဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ အချက်အလက်များကို ရယူနိုင်ရန်၊ ဖြေရှင်းချက်တွင် NMR ကိုအသုံးပြု၍ LLPS စနစ်အား လေ့လာရန် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။သို့သော်၊ ကွဲကွာနေသောအဆင့်တွင် ကျန်ရှိနေသော αS အပိုင်းကို ကျွန်ုပ်တို့သာလျှင် ရှာဖွေနိုင်သည်၊ ၎င်းမှာ coacervate အတွင်းရှိ ပရိုတင်းဒိုင်းနမစ်များကို လျှော့ချပေးပြီး NMR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ဖြေရှင်းချက်၏အောက်ခြေရှိ သိပ်သည်းသောအဆင့်ကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။NMR (Supplementary Fig. 5c, d) ကို အသုံးပြု၍ LLPS နမူနာ၏ ပြန့်ကျဲနေသော အဆင့်တွင် ကျန်ရှိနေသော ပရိုတင်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံနှင့် ဒိုင်နမစ်များကို ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာကြည့်သောအခါတွင် ပရိုတင်းသည် pLK နှင့် ΔNt-Tau ၏ရှေ့မှောက်တွင် တစ်ပုံစံတည်းနီးပါး ရှိနေသည်ကို သတိပြုမိပါသည်။ ပရိုတင်းကျောရိုး၏ အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ဒိုင်းနမစ်တွင်ရှိသော၊ အလယ်တန်း ဓာတုပြောင်းလဲမှုနှင့် R1ρ ပြေလျော့ခြင်းဆိုင်ရာ စမ်းသပ်မှုများက ဖော်ပြသည်။NMR ဒေတာက αS ၏ C-terminus သည် polycations နှင့် ၎င်း၏အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကြောင့် ကျန်ပရိုတင်းစည်းရိုးများကဲ့သို့ ၎င်း၏ချို့ယွင်းသောသဘောသဘာဝကို ထိန်းသိမ်းထားစဉ်တွင် ပုံစံတူပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ဆုံးရှုံးမှုကို ကြုံတွေ့ရကြောင်းပြသသည်။
TEMPOL-122-αS နို့ဆီအဆင့်တွင်တွေ့ရှိရသော CW-EPR အချက်ပြကျယ်ပြန့်မှုသည် polycations နှင့် ပရိုတင်း၏အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို ထင်ဟပ်နေသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LLPS မရှိတော့သည့်အချိန်တွင် αS ၏ ဆက်စပ်ဆက်စပ်မှုကို အကဲဖြတ်ရန် EPR titration ကိုလုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ Buffer LLPS)၊ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် ပျော့ပြောင်းပြီး စုစည်းမှုအဆင့်များတွင် အတူတူပင်ဖြစ်သည် (ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာ၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4a နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 6) မှ အတည်ပြုသည်။ရည်ရွယ်ချက်မှာ coacervates များအားလုံးသည် ၎င်းတို့၏ ဘုံအရည်နှင့်တူသော ဂုဏ်သတ္တိများရှိနေသော်လည်း မော်လီကျူးအဆင့်တွင် နောက်ခံကွဲပြားသည့်အမူအကျင့်တစ်ခုခုကို ပြသခြင်းရှိမရှိ ကြည့်ရှုရန်ဖြစ်သည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ EPR spectrum သည် polycation အာရုံစူးစိုက်မှု တိုးလာခြင်းဖြင့် ကျယ်ပြန့်လာပြီး အပြန်အလှန်ဆက်ဆံဖော်အားလုံး၏ မော်လီကျူးတုံ့ပြန်မှုများကြောင့် မော်လီကျူးပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ် လျော့နည်းသွားခြင်း (ပုံ။ 3e၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 6)။pLK သည် ΔNt-Tau နှင့် Tau441 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အံသွားအချိုးနိမ့်သော (polycation:αS) ဖြင့် ရရှိသည်။တကယ်တော့၊ n တူညီပြီး အမှီအခိုကင်းသော ချိတ်ဆိုဒ်များဟု ယူဆရသည့် အနီးစပ်ဆုံး စည်းနှောင်မှုပုံစံတစ်ခုနှင့် ဒေတာကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်လျှင် pLK (~5 μM) ၏ ထင်ရှားသော ကွဲကွာမှုသည် Tau441 သို့မဟုတ် ΔNt-Tau (~50 μM) ထက် ပြင်းအားနိမ့်ကြောင်းပြသခဲ့သည် )µM)၎င်းသည် အကြမ်းဖျင်း ခန့်မှန်းချက်ဖြစ်သော်လည်း၊ αS သည် စဉ်ဆက်မပြတ် အပြုသဘောဆောင်သော အားသွင်းဧရိယာများပါရှိသော ပိုမိုရိုးရှင်းသော polycation များအတွက် ပိုမိုဆက်စပ်မှုရှိသည်ကို ညွှန်ပြနေသည်။αS နှင့် အမျိုးမျိုးသော polycations များကြားတွင် ဆက်စပ်မှုရှိသော ဤကွာခြားချက်ကြောင့် ၎င်းတို့၏ အရည်ဂုဏ်သတ္တိများသည် အချိန်နှင့်အမျှ ကွဲပြားနိုင်ပြီး ကွဲပြားသော LSPT လုပ်ငန်းစဉ်များကို ခံစားရနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။
ပရိုတိန်း coacervate အတွင်းရှိ အလွန်လူစည်ကားသော ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် ပရိုတင်း၏ amyloid သဘောသဘာဝအရ၊ ဖြစ်နိုင်သော LSPT လုပ်ငန်းစဉ်များကို သိရှိရန် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ coacervate ၏အပြုအမူကို ကျွန်ုပ်တို့ စောင့်ကြည့်လေ့လာခဲ့ပါသည်။BF နှင့် CF မိုက်ခရိုစကုပ် (ပုံ 4) ကို အသုံးပြု၍ αS/Tau441 သည် ဖြေရှင်းချက်တွင် ကြီးမားသောအတိုင်းအတာအထိ ပေါင်းစပ်ကာ ရေတွင်း/ဆလိုက်၏အောက်ခြေမျက်နှာပြင်ကို စိုစွတ်စေသော အမှုန်အမွှားကြီးများဖွဲ့စည်းကာ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း အမှုန်အမွှားများအပြည့်အဖြစ် ရေတွင်း/ဆလိုက်အောက်ခြေမျက်နှာပြင်ကို စိုစွတ်စေသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ .7d);ဤအောက်ခြေဖွဲ့စည်းပုံများကို “ပရိုတင်းဖောင်များ” ဟုခေါ်သည်။ဤဖွဲ့စည်းပုံများသည် ပေါင်းစပ်နိုင်စွမ်း (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 7b) ကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားသောကြောင့် အရည်အဖြစ် ဆက်လက်တည်ရှိပြီး LLPS ကို အစပျိုးပြီးနောက် နာရီပေါင်းများစွာကြာအောင် မြင်တွေ့နိုင်သည် (ပုံ 4 နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 7c)။အီလက်ထရွန်းနစ် coacervates များအတွက် မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း ရေစွတ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်သည် hydrophilic ပစ္စည်းများထက် hydrophilic ၏ မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် မျက်နှာသာပေးသည်ကို လေ့လာတွေ့ရှိရပါသည်။ထင်ရှားသည်မှာ၊ αS/ΔNt-Tau ပေါင်းစပ်မှုနှင့် ဖောင်စီးခြင်းတို့သည် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသော်လည်း αS/pLK ကွန်ဒွန်စင်များ သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသည် (ပုံ။ 4)။ပေါက်ဖွားသည့်အချိန်တိုအတွင်း၊ αS/pLK အမှုန်အမွှားများသည် hydrophilic မျက်နှာပြင်ကို ပေါင်းစပ်ကာ စိုစွတ်နိုင်သော်လည်း ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် လျင်မြန်စွာရပ်တန့်သွားပြီး 5 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားပြီးနောက်တွင် အကန့်အသတ်ရှိသော ပေါင်းစပ်ဖြစ်ရပ်များသာဖြစ်ပြီး စိုစွတ်မှုကို တွေ့ရှိရပါသည်။- gel-drip အသွင်ပြောင်းခြင်း။
100 µM Tau441 (အပေါ်ပိုင်း) ΔN ဖိုရိုပစ်စင် Δ441 မိုက်ခရိုစပီဆင်းပုံများ ရှိနေခြင်းတွင် 100 µM Tau441 မိုက်ခရိုစပီနစ် မိုက်ခရိုစပယ်စင် ပါ၀င်သော ကိုယ်စားပြု BF (အမဲရောင်အကန့်များ)၊ -Tau (အလယ်) သို့မဟုတ် 1 mM pLK (အောက်ခြေ) တွင် မတူညီသော ပေါက်ဖွားချိန်နှင့် ဆုံမှတ်အမြင့်များ (z၊ ပန်းကန်ပြားအောက်ခြေမှ အကွာအဝေး)။စမ်းသပ်မှုများအား တစ်ခုနှင့်တစ်ခု သီးခြားခွဲ၍ 4-6 ကြိမ် ထပ်ခါတလဲလဲ ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။αS/Tau441 coacervates များကို 24 နာရီအကြာတွင် စိုစွတ်ပြီး ပုံထက် ပိုကြီးသော ဖောင်များ ဖြစ်ပေါ်လာသည်။ပုံအားလုံးအတွက် စကေးဘားသည် 20 µm ဖြစ်သည်။
ထို့နောက် αS/Tau441 LLPS တွင်ဖွဲ့စည်းထားသော ကြီးမားသောအရည်နှင့်တူသောပရိုတိန်းကန်များသည် လေ့လာထားသော ပရိုတိန်းများ၏ amyloid ပေါင်းစည်းမှုကို ဦးတည်စေမည်လောဟု ကျွန်ုပ်တို့မေးခဲ့သည်။အထက်ဖော်ပြပါ တူညီသောအခြေအနေများအောက်တွင် WF အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ αS/Tau441 အစက်များ၏ ရင့်ကျက်မှုကို လိုက်နာခဲ့သော်လည်း 1 μM AF488-တံဆိပ်တပ် αS နှင့် Atto647N-တံဆိပ်တပ်ထားသော Tau441 (ပုံ. 5a) ကို အသုံးပြုထားသည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရင့်ကျက်မှုဖြစ်စဉ်တစ်လျှောက်လုံး ပရိုတိန်းဒေသခံအဖြစ် ပြောင်းလဲခြင်းကို လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက ca.5 နာရီကြာပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့ဟုခေါ်သော “အမှတ်များ” ဟုခေါ်သော ဖောင်များအတွင်းတွင် ပိုမိုပြင်းထန်သော စက်ဝိုင်းပုံမဟုတ်သော အဆောက်အဦများကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ အချို့မှာ αS ဖြင့် colocalized လုပ်ပြီး အချို့ကို Tau441 တွင် ကြွယ်ဝစေသည် (ပုံ 5a၊ မြှားဖြူများ)။ဤအစက်အပြောက်များကို αS/ΔNt-Tau ထက် αS/ΔNt-Tau အတွက် ပိုမိုကောင်းမွန်သောအတိုင်းအတာအထိ ဖောင်များအတွင်း အမြဲတွေ့မြင်ရပါသည်။ပေါင်းခြင်း/စိုစွတ်ခြင်းအတွက် အရည်အချင်းမပြည့်မီသော pLK နှင့် Tau စနစ်များ၏ အစက်အပြောက်များတွင် ကွဲပြားသောအစက်အပြောက်မရှိခဲ့ပါ။αS နှင့် Tau441 ပါရှိသော ဤအစွန်းအထင်းများသည် amyloid-like အစုလိုက်ဟုတ်မဟုတ် စမ်းသပ်ရန်အတွက် Tau441 ကို Atto647N နှင့် 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) ဖြင့် CF microscopy ကိုအသုံးပြု၍ အလားတူစမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ဆိုးဆေး။αS/Tau441 အမှုန်အမွှားများ သို့မဟုတ် ဖောင်များပေါက်ဖွားပြီး 24 နာရီအကြာတွင်ပင် ThT-စွန်းထင်းခြင်းကို မတွေ့ရှိရသော်လည်း (ပုံ. 5b၊ အပေါ်ဆုံးအတန်း—ပရိုတင်းဖောင်များပေါ်တွင်ကျန်နေသောအမှုန်အမွှားများ)၊ ဖောင်အတွင်းရှိ Atto647N-Tau441 ပါဝင်သော ThT-positive တည်ဆောက်ပုံများသည် အလွန်အားနည်းပါသည်။၎င်းသည် ယခင်ဖော်ပြထားသော အစက်အပြောက်များ၏ အရွယ်အစား၊ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် တည်နေရာကို ပုံတူပွားခြင်း (ပုံ။ 5b၊ အလယ်တန်းနှင့် အောက်တန်းများ)၊ အစက်အပြောက်များသည် အိုမင်းရင့်ရော်သော အရည် coacervates တွင်ဖွဲ့စည်းထားသော amyloid-like အစုအဝေးများနှင့် ဆက်စပ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုပါသည်။
ပေါက်ဖွားချိန်အမျိုးမျိုးတွင် WF 25 μM αS သည် 25 μM Tau441 (1 μM AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS နှင့် Atto647N-တံဆိပ်တပ်ထားသော Tau441) ရှိသည့် အဏုကြည့်အဏုကြည့်အပြားရှိ ရေတွင်းတစ်ခုတွင် ဆုံမှတ်အမြင့်များ (z၊ အကွာအဝေး)၊ .အလားတူ ရလဒ်များဖြင့် စမ်းသပ်မှု ခြောက်ခုကို လွတ်လပ်စွာ ထပ်ခါထပ်ခါ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။b CF အဏုကြည့်ရုပ်ပုံသည် 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-တံဆိပ်တပ် Tau441) နှင့် 12.5 μM thioflavin-T (ThT) ၏ရှေ့မှောက်တွင် CF ​​အဏုကြည့်ရုပ်ပုံ။အလေးချိန်ရှိသော ပရိုတင်းအမှုန်အမွှားများနှင့် စုဆောင်းထားသော ပရိုတင်းဖောင်များနှင့် အစက်အပြောက်များကို ထိပ်နှင့်အလယ်တန်းတွင် အသီးသီးပြသထားသည်။အောက်ခြေအတန်းသည် သီးခြားပုံတူပွား 3 ခုမှ ဖောင်များနှင့် အစက်များပုံများကို ပြသထားသည်။အဖြူရောင်မြှားများသည် အကန့်နှစ်ခုလုံးရှိ ThT-positive အစက်များကို ညွှန်ပြသည်။ပုံအားလုံးအတွက် စကေးဘားသည် 20 µm ဖြစ်သည်။
အရည်မှ အစိုင်အခဲသို့ ကူးပြောင်းသည့်ကာလအတွင်း coacervate ပရိုတင်းကွန်ရက်ရှိ အပြောင်းအလဲများကို အသေးစိတ်စစ်ဆေးရန်အတွက် fluorescence lifetime imaging (FLIM) နှင့် Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (ပုံ 6 နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံများ 8 နှင့် 9) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။အလွှာ၏ coacervate ရင့်ကျက်မှုသည် ပိုမိုပေါင်းစပ်ထားသော သို့မဟုတ် အစိုင်အခဲကဲ့သို့ စုစည်းထားသော ပရိုတိန်းဖွဲ့စည်းပုံအဖြစ်သို့ ဆက်စပ်နေသော ပရိုတင်းနှင့် fluorescent probe အကြား ပိုမိုနီးကပ်စွာ ထိတွေ့မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်၊၊ တိုတောင်းသော probe သက်တမ်း (τ) တွင် ထင်ရှားသည့် quenching effect ကို ထုတ်လုပ်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။ 40 တွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊၄၁ ၊၄၂။ထို့အပြင်၊ နှစ်ဆတံဆိပ်တပ်ထားသောနမူနာများ (AF488 နှင့် Atto647N တို့အတွက် FRET အလှူရှင်နှင့် လက်ခံသူဆိုးဆေးများ အသီးသီးအတွက်)၊ ဤကျဆင်းမှုသည် τ တွင် coacervate ငွေ့ရည်ဖွဲ့ခြင်းနှင့် LSPT ကာလအတွင်း FRET(E) ထိရောက်မှုတိုးလာခြင်းဖြင့်လည်း လိုက်ပါသွားနိုင်သည်။LLPS αS/Tau441 နှင့် αS/ΔNt-Tau နမူနာများတွင် ဖေါင်ဖောင်နှင့် အစက်အပြောက်များ ဖြစ်ပေါ်ခြင်းကို အချိန်နှင့်အမျှ စောင့်ကြည့်စစ်ဆေးခဲ့သည် (1 µM AF488 αS နှင့်/သို့မဟုတ် Tau441 သို့မဟုတ် ΔNt-Tau တံဆိပ်တပ်ထားသော LLPS ကြားခံတစ်ခုစီတွင် ပရိုတင်းတစ်ခုစီ၏ 25 µM)။AF488 (τ488) နှင့် Atto647N (τ647N) probes များ၏ fluorescence lifetime တွင် ယေဘူယျလမ်းကြောင်းကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ။ 6 နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 8c)။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ ဤပြောင်းလဲမှုသည် ဖောင်များအတွင်း အစက်များ (ပုံ. 6c) အတွက် သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးထားပါသည်။၎င်းကိုထောက်ခံသည့်အနေဖြင့်၊ 24 နာရီသက်တမ်းရှိ αS/ΔNt-Tau အမှုန်အမွှားများအတွက် fluorescence တစ်သက်တာတွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုမရှိကြောင်း (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 8d)၊ droplet gelation သည် အစက်အပြောက်နှင့်ထူးခြားသောဖြစ်စဉ်ဖြစ်ပြီး ၎င်းသည် သိသာထင်ရှားသောမော်လီကျူးပြန်လည်ဖွဲ့စည်းမှုဖြင့်မတွဲပါ။ coacervates အတွင်း။အထူးသဖြင့် αS/Tau441 စနစ်အတွက် အစက်များသည် αS တွင် မတူညီသော အရွယ်အစားနှင့် ပြောင်းလဲနိုင်သော အကြောင်းအရာများ ရှိသည်ကို သတိပြုသင့်သည်။အထူးသဖြင့် Atto647N တံဆိပ်တပ်ထားသော Tau441 (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8a) အတွက် ပြင်းထန်မှု တိုးလာခြင်းနှင့် အတူ αS/Tau441 နှင့် αS/ΔNt-Tau စနစ်နှစ်ခုစလုံးအတွက် FRET ပိုမိုမြင့်မားသော FRET ထိရောက်မှုကို ညွှန်ပြသည်၊၊ နောက်ထပ် ပေါင်းစည်းထားသော နာရီများကို ညွှန်ပြသည်။ အစပျိုးပြီးနောက်၊ တည်ငြိမ်လျှပ်စစ်ဓာတ်အတွင်းရှိ ပရိုတင်းများသည် နို့ဆီများ ကျသွားသည်။αS/ΔNt-Tau နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ αS/Tau441 အစက်အပြောက်များတွင် τ647N နိမ့်ပြီး τ488 တန်ဖိုးများ အတန်ငယ် ပိုမြင့်သည်ကို တွေ့ရှိရသည်၊၊ နိမ့်သည်နှင့် ပိုမတူညီသော FRET တန်ဖိုးများဖြင့် ပါသွားပါသည်။ဖြစ်နိုင်သည်မှာ၊ αS/Tau441 စနစ်တွင် လေ့လာတွေ့ရှိပြီး မျှော်လင့်ထားသည့် αS များပြားမှုသည် Tau နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မကြာခဏ ခွဲထွက်နိုင်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် Tau441 ကိုယ်တိုင်သည်လည်း LLPS နှင့် ပေါင်းစည်းခြင်း (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 8e) ဖြစ်သည်ဟူသောအချက်နှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်သည်။ .သို့သော်၊ အစက်အပြောက်များ ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းမှု၊ ဖောင်ဖွဲ့စည်းမှုနှင့် အရေးကြီးသည်မှာ၊ Tau441 နှင့် αS နှစ်ခုစလုံးတွင် အရည်ကဲ့သို့သော coacervates အတွင်း ပရိုတင်းများ စုစည်းမှုသည် အများဆုံးဖြစ်သည်။
ပရိုတင်းတစ်ခုစီ၏ 25 μM (1 μM AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS နှင့် 1 μM Atto647N-တံဆိပ်တပ် Tau441 သို့မဟုတ် ΔNt-Taubuff) တွင် αS/Tau441 နှင့် αS/ΔNt-Tau ၏တစ်သက်တာမီးချောင်းအဏုစကုပ်ပုံ (FLIM) ပုံများ။ကော်လံများသည် မတူညီသော ရင့်ကျက်ချိန်များတွင် LLPS နမူနာပုံများကို ပြသသည် (30 မိနစ်၊ 5 နာရီနှင့် 24 နာရီ)။အနီရောင်ဘောင်သည် αS/Tau441 အစက်အပြောက်များပါရှိသော ဒေသကို ပြသသည်။သက်တမ်းများကို အရောင်ဘားများအဖြစ် ပြထားသည်။ပုံအားလုံးအတွက် စကေးဘား = 20 µm။b ကွက်လပ် a ရှိ အနီရောင်အကွက်တွင် ပြသထားသော ရွေးထားသောဧရိယာ၏ FLIM ပုံကို ချဲ့ကြည့်ပါ။အကန့် a တွင်ကဲ့သို့ တူညီသောအရောင်စကေးကို အသုံးပြု၍ အသက်အပိုင်းအခြားများကို ပြထားသည်။စကေးဘား = 5 µm ။c ကွဲပြားသောပရိုတိန်းမျိုးစိတ်များ (droplets-D-, raft-R- နှင့် speckle-P) အတွက် AF488 (αS) သို့မဟုတ် Atto647N (ပူးတွဲ) ကိုပြသသည့် ဟစ်စတိုဂရမ်များသည် Tau441 အတွက်မှတ်တမ်းတင်ထားသည့် FLIM ပုံများတွင် ဖော်ပြထားသော အချိန်ကိုက်ဖြန့်ဝေမှု သက်တမ်းတစ်လျှောက် Tau441 နှင့် αS/ΔNt-Tau coacervate နမူနာများ (D အတွက် N = 17-32 ROI၊ R အတွက် 29-44 ROI နှင့် အမှတ်များအတွက် 21-51 ROI)။ပျမ်းမျှနှင့် ပျမ်းမျှတန်ဖိုးများကို အဝါရောင်စတုရန်းများနှင့် အနက်ရောင်မျဉ်းများအဖြစ် အသီးသီးပြထားသည်။ဘောက်စ်၏ အောက်နှင့် အထက်ဘောင်များသည် ပထမနှင့် တတိယမြောက် ကွာတားများကို ကိုယ်စားပြုပြီး 1.5-fold interquartile range (IQR) အတွင်း အနိမ့်ဆုံးနှင့် အမြင့်ဆုံးတန်ဖိုးများကို ပါးသိုင်းမွှေးများအဖြစ် ပြသထားသည်။အစွန်းများကို အနက်ရောင်စိန်များအဖြစ် ပြသထားသည်။ဖြန့်ချီမှုအတွဲများကြားတွင် ကိန်းဂဏန်းအချက်အလတ်အဓိပ္ပယ်ကို မညီမျှသောကွဲလွဲမှုများဟု ယူဆကာ နမူနာနှစ်ခု t-test ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။နှိုင်းယှဉ်ဒေတာအတွဲတစ်ခုစီအတွက် အမြီးနှစ်ကြောင်းရှိသော t-test p-တန်ဖိုးများကို ခရေပွင့်များဖြင့် ပြသသည် (* p-value > 0.01၊ ** p-value > 0.001၊ *** p-value > 0.0001၊ **** p-value > 0.00001), ns သည် ပေါ့ဆမှုမရှိခြင်းကို ညွှန်ပြသည် (p-value > 0.05)။အတိအကျ p တန်ဖိုးများကို နောက်ဆက်တွဲဇယား 1 တွင် ပေးထားပြီး မူရင်းဒေတာကို ကုန်ကြမ်းဒေတာဖိုင်များအဖြစ် တင်ပြပါသည်။
အမှုန်အမွှားများ/စုစည်းမှုများ၏ amyloid နှင့်တူသော သဘာ၀ကို ထပ်မံပြသရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပရိုတင်း coacervates မှ အစုလိုက်များကို ခွဲထုတ်လိုက်သော ပြင်းအားမြင့်မားသော (1 M) NaCl ဖြင့် 24 နာရီကြာ ကုသခဲ့ပါသည်။အထီးကျန် အစုလိုက် (ဆိုလိုသည်မှာ အစုလိုက် ပြန့်ကျဲနေသော အဖြေ) ကို atomic force microscopy (AFM) ကို အသုံးပြု၍ တွေ့ရှိသောအခါ၊ ပုံမှန် 15 nm ခန့် အမြင့်ရှိသော ဆားပါဝင်မှု မြင့်မားသော အခြေအနေများအောက်တွင် တွဲဆက်လေ့ရှိသော သာမာန် လုံး၀ ပုံသဏ္ဍာန်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ မျက်နှာပြင်ပေါ်ရှိ ပြင်းထန်သော hydrophobic အကျိုးသက်ရောက်မှုကြောင့် ပုံမှန် amyloid fibrils ၏အပြုအမူ ( fibrils သည် ပုံမှန်အားဖြင့် ~10 nm မြင့်သည်ကို သတိပြုပါ) (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 10a)။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ စံ ThT fluorescence စစ်ဆေးမှုတစ်ခုတွင် ThT နှင့် သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော ပေါင်းစည်းများကို ပေါက်ဖွားလာသောအခါ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ThT fluorescence quantum အထွက်နှုန်းကို သိသိသာသာ တိုးမြင့်လာသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့ရသည်၊၊ ဆိုးဆေးကို ပုံမှန် αS amyloid fibrils ဖြင့် ပေါက်ဖွားလာသောအခါတွင် တွေ့ရှိခဲ့ရသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 10b အကြံပြုထားသည်)၊ coacervate aggregates တွင် amyloid ကဲ့သို့သော တည်ဆောက်ပုံများ ပါဝင်သည်။.တကယ်တော့၊ အစုလိုက်များသည် မြင့်မားသောဆားပါဝင်မှုဒဏ်ကို ခံနိုင်ရည်ရှိသော်လည်း ပုံမှန် amyloid fibrils (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 10c) ကဲ့သို့ 4 M guanidine chloride (GdnHCl) ကို အထိမခံနိုင်ပါ။
ထို့နောက်၊ တစ်ခုတည်းသောမော်လီကျူးမီးချောင်း၊ တိကျသော fluorescence ဆက်စပ်မှု/ဖြတ်ကျော်ဆက်နွှယ်မှု spectroscopy (FCS/FCCS) နှင့် နှစ်ရောင်တိုက်ဆိုင်မှုရှာဖွေခြင်း (TCCD) ကိုအသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ဤအချက်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် αS နှင့် Tau441 (25 μM နှစ်ခုလုံး) ပါဝင်သော 100 μl LLPS နမူနာများတွင် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် ဖြစ်ပေါ်လာသော အစုအဝေးများကို 1 μM AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS နှင့် 1 μM Atto647N-တံဆိပ်တပ်ထားသော Tau441 တို့နှင့်အတူ သီးခြားခွဲထားသည်။LLPS နှင့် ပရိုတင်းတို့ကြားဖြစ်နိုင်သော electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို တားဆီးရန် တူညီသော PEG-free ကြားခံနှင့် 1 M NaCl (တူညီသောကြားခံအဖြစ်အသုံးပြုသည့်ကြားခံ) ကို အသုံးပြု၍ ရရှိလာသော ပြန့်ကျဲနေသောပေါင်းစပ်ဖြေရှင်းချက်ကို မိုနိုမိုလီကျူလာအခြေအနေသို့ ပျော့ပြောင်းလိုက်ပါ။မော်လီကျူးတစ်ခု၏ အချိန်လမ်းကြောင်း၏ ဥပမာကို ပုံ 7a တွင်တွေ့နိုင်ပါသည်။FCCS/FCS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ဖြတ်ကျော်ဆက်နွယ်မှု၊ CC နှင့် အလိုအလျောက်ဆက်နွယ်မှု၊ AC) သည် နမူနာများတွင် αS နှင့် tau ပါဝင်သော အစုအဝေးများ ပေါများကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 7b တွင် CC မျဉ်းကွေးကိုကြည့်ပါ) နှင့် ကျန်ရှိသောမိုနိုမာရစ်ပရိုတင်းများ ပိုလျှံလာသည်ကို တွေ့ရပါသည်။ dilution လုပ်ငန်းစဉ်၏ရလဒ် (ပုံ 7b၊ ဘယ်ဘက်ဘောင်တွင် AC မျဉ်းကွေးများကိုကြည့်ပါ)။monomeric ပရိုတိန်းများသာပါရှိသောနမူနာများကိုအသုံးပြု၍ တူညီသောအဖြေအခြေအနေအောက်တွင်ပြုလုပ်ခဲ့သော ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှုများတွင် CC မျဉ်းကွေးများမတွေ့ရှိရဘဲ monomeric ပရိုတင်းများမျှော်လင့်ထားသောပျံ့နှံ့မှုကိန်းဂဏန်းများရှိသည့် AC မျဉ်းကွေးများသည် one-component diffusion model (Eq. 4) နှင့် ကောင်းစွာလိုက်ဖက်သည် (ပုံ။ 7b ) ညာဘက်ဘောင်)။စုစည်းထားသော အမှုန်များ၏ ပျံ့နှံ့မှုကိန်းဂဏန်းမှာ 1 µm2/s ထက်နည်းပြီး မိုနိုမာရစ်ပရိုတင်းများ၏ 1 µm2/s ခန့်ဖြစ်သည်။50-100 µm/s;တန်ဖိုးများသည် sonicated αS amyloid fibrils နှင့် monomeric αS အတွက် အလားတူဖြေရှင်းချက်အခြေအနေများ44 အောက်တွင် သီးခြားစီထုတ်ဝေထားသော တန်ဖိုးများနှင့် ဆင်တူသည်။TCCD ပေါက်ကွဲမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ပုံ 7c၊ ထိပ်ပိုင်းအကန့်) ဖြင့် စုစည်းမှုများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသောအခါတွင် သီးခြားအစုလိုက် (αS/Tau heteroaggregate) တစ်ခုစီတွင် αS နှင့် tau နှစ်မျိုးလုံးပါရှိသော 60% ခန့်၊ 30% ခန့်သာ ပါရှိသည်ကို တွေ့ရှိရပါသည်။ tau၊ 10% αS သာ။αS/Tau heteroaggregates များ၏ Stoichiometric ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် heteroaggregates အများစုသည် tau (stoichiometry 0.5 အောက်၊ ပျမ်းမျှ tau မော်လီကျူးအရေအတွက်သည် αS မော်လီကျူးများထက် 4 ဆပိုများသည်) သည် FLIM တွင် ကျွန်ုပ်တို့၏အလုပ်နှင့် ကိုက်ညီသော၊ စမ်းသပ်မှုများ။.FRET ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ဤစုပေါင်းတွင် ပရိုတင်းနှစ်မျိုးလုံးပါ၀င်ကြောင်း၊ ဤကိစ္စတွင် အမှန်တကယ် FRET တန်ဖိုးများသည် အလွန်အရေးမကြီးသော်လည်း၊ အစုလိုက်တစ်ခုစီတွင် fluorophores ဖြန့်ဖြူးမှုသည် စမ်းသပ်မှုတွင် အသုံးပြုထားသောတံဆိပ်မပါသော ပရိုတင်းများပိုလျှံနေသောကြောင့် ကျပန်းဖြစ်နေသောကြောင့်ဖြစ်သည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 45,46 ရင့်ကျက်သော amyloid စုစည်းမှု-ချို့တဲ့သော Tau မူကွဲကို အသုံးပြု၍ တူညီသောခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်သောအခါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11a၊b ကိုကြည့်ပါ)၊ αS electrostatic aggregation သည် အတူတူပင်ဖြစ်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 11c၊ d)၊ coacervate အတွင်းရှိ အစုလိုက်ဖွဲ့စည်းနိုင်စွမ်းကို သိသိသာသာ လျော့ကျသွားခဲ့ပြီး FLIM သည် situ စမ်းသပ်မှုများတွင် အစက်အပြောက်များစွာကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော အစုလိုက်နမူနာများအတွက် အားနည်းသော အပြန်အလှန်ဆက်နွယ်မှုမျဉ်းကွေးများကို လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။သို့သော်၊ ရှာဖွေတွေ့ရှိထားသော အစုလိုက်အနည်းစုအတွက် ( Tau441 ၏ ဆယ်ပုံတစ်ပုံမျှသာ) အတွက် စုစည်းမှုတစ်ခုစီသည် αS မော်လီကျူးများသာပါရှိသော တွေ့ရှိရသောပေါင်းစု၏ 50% ခန့်ရှိပြီး ဤ Tau မျိုးကွဲထက် αS တွင် ပေါင်းစပ်ကြွယ်ဝကြောင်းတွေ့ရှိရပြီး၊ αS သည် ကွဲလွဲနေသည် .ပေါင်းစည်းမှုများ (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 11e ကိုကြည့်ပါ)ဤစမ်းသပ်မှုများ၏ရလဒ်များက αS ကိုယ်တိုင်သည် coacervate အတွင်း tau နှင့် စုဆောင်းနိုင်စွမ်းရှိသော်လည်း tau nucleation သည် ဤအခြေအနေများအောက်တွင် ပို၍အဆင်ပြေပြီး ရလဒ်ထွက်ရှိသော amyloid-like aggregates များသည် αS နှင့် tau ၏ပုံစံတစ်ခုအဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်သည်ကိုပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ tau-ကြွယ်ဝသော core ကိုဖွဲ့စည်းပြီးသည်နှင့်, αS နှင့် tau အကြား heterotypic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို tau မော်လီကျူးများအကြား homotypic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများအပေါ် အစုလိုက်အပြုံလိုက်အားဖြင့် နှစ်သက်သည်။အရည် αS/tau coacervates တွင် ပရိုတင်းကွန်ရက်များကိုလည်း စောင့်ကြည့်လေ့လာပါသည်။
αS/Tau441 electrostatic coacervates တွင်ဖွဲ့စည်းထားသော အထီးကျန်ပေါင်းစည်းမှုတစ်ခုတည်းမော်လီကျူးများ၏ကိုယ်စားပြု fluorescence ယာယီခြေရာများ။αS/Tau441 coaggregates များ (ညွှန်ပြထားသည့် အတိုင်းအတာထက် ပေါက်ကွဲခြင်း) နှင့် သက်ဆိုင်သော ပေါက်ကွဲမှုများကို ထောက်လှမ်းခြင်း ချန်နယ် သုံးခု (AF488 နှင့် Atto647N မှ တိုက်ရိုက် လှုံ့ဆော်မှု၊ အပြာနှင့် အနီရောင်မျဉ်းများ၊ သွယ်ဝိုက်သော လှုံ့ဆော်မှုပြီးနောက် Atto647N ထုတ်လွှတ်မှု)၊ FRET၊ ခရမ်းရောင်လိုင်း)b LLPS (ဘယ်ဘက်ဘောင်) မှရရှိသော သီးခြား αS/Tau441 စုစည်းမှုနမူနာကို FCS/FCCS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။AF488 နှင့် Atto647N အတွက် Autocorrelation (AC) မျဉ်းကွေးများကို အပြာနှင့် အနီရောင်ဖြင့် အသီးသီးပြသထားပြီး ဆိုးဆေးနှစ်မျိုးလုံးပါရှိသော ပေါင်းစပ်ဆက်စပ်မှုများနှင့် ဆက်စပ်နေသော အပြန်အလှန်ဆက်နွယ်မှု (CC) မျဉ်းကွေးများကို ခရမ်းရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။AC မျဉ်းကွေးများသည် တံဆိပ်တပ်ထားသော monomeric နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ပရိုတိန်းမျိုးစိတ်များ ရှိနေခြင်းကို ထင်ဟပ်စေပြီး CC မျဉ်းကွေးများသည် တံဆိပ်နှစ်ထပ်တပ်ထားသော စုစည်းမှုများ ပျံ့နှံ့မှုကိုသာ ပြသသည်။တူညီသောခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများ၊ သို့သော် သီးခြားအစက်အပြောက်များကဲ့သို့ တူညီသောအဖြေအခြေအနေများအောက်တွင်၊ monomeric αS နှင့် Tau441 သာရှိသောနမူနာများကို ညာဘက်ဘောင်ရှိ ထိန်းချုပ်မှုများအဖြစ် ပြသထားသည်။c αS/Tau441 electrostatic coacervates တွင် ဖွဲ့စည်းထားသော အထီးကျန်အစုအဝေးများ၏ တစ်ခုတည်းသော မော်လီကျူးများ၏ ဖလူအိုရီစတက်ဖလက်ရှ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။မတူညီသော ထပ်ခါတလဲလဲ လေးကြိမ်တွင် တွေ့ရသော အစုလိုက်တစ်ခုစီအတွက် အချက်အလက် (N = 152) သည် ၎င်းတို့၏ stoichiometry၊ S တန်ဖိုးများနှင့် FRET ထိရောက်မှု (အပေါ်ဆုံးအကန့်၊ အရောင်ဘားသည် ဖြစ်ပျက်မှုကို ရောင်ပြန်ဟပ်သည်) နှင့် ဆန့်ကျင်သည်။ပေါင်းစည်းမှု အမျိုးအစားသုံးမျိုးကို ခွဲခြားနိုင်သည်--αS-တစ်ခုတည်းသော ပေါင်းစည်းမှုများ၊ S~0 နှင့် FRET~1 ဖြင့် Tau-သာလျှင် စုစည်းမှုများ၊ နှင့် ပမာဏ၏ အလယ်အလတ် S နှင့် FRET ခန့်မှန်းခြေများနှင့် ကွဲပြားသော Tau/αS ပေါင်းစည်းမှုများ ကွဲပြားသော အစုလိုက်တစ်ခုစီတွင် တွေ့ရှိသည့် အမှတ်အသား ပရိုတိန်း နှစ်ခုစလုံး၏ (N=100) ကို အောက်အကန့်တွင် ပြသည် (အရောင်စကေးသည် ဖြစ်ပျက်မှုကို ရောင်ပြန်ဟပ်သည်)။ဒေတာအကြမ်းကို ဒေတာအကြမ်းဖိုင်များပုံစံဖြင့် ပေးပါသည်။
အရည်ပရိုတိန်း၏ ရင့်ကျက်မှု သို့မဟုတ် အိုမင်းခြင်းသည် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ ဂျယ်လ်ကဲ့သို့ သို့မဟုတ် အစိုင်အခဲဖွဲ့စည်းပုံများအဖြစ်သို့ condensate47 ၏ ဇီဝကမ္မလုပ်ဆောင်မှုများအပြင် ရောဂါတွင် ပါဝင်နေကြောင်း၊ amyloid စုစည်းမှု 7၊ 48၊ 49 မတိုင်မီ ပုံမှန်မဟုတ်သောလုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုအဖြစ် ဤနေရာတွင် အဆင့်ခွဲခြားခြင်းနှင့် အပြုအမူတို့ကို အသေးစိတ်လေ့လာပါသည်။LSPT αS သည် ထိန်းချုပ်ထားသော ပတ်ဝန်းကျင်တွင် သေးငယ်သော မိုလာပါဝင်မှုနည်းသော အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာအခြေအနေများတွင် ကျပန်း polycations များရှိနေခြင်းတွင် (တွက်ချက်ထားသော αS ၏ ဇီဝကမ္မအာရုံစူးစိုက်မှုသည် > 1 µM50 ဖြစ်သည်)၊ LPS ၏ သာမာန်အပူချိန်ဒိုင်နမစ်နည်းဖြင့်မောင်းနှင်သောအပြုအမူကို သတိပြုပါ။ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ pH တွင် အလွန်အနုတ်လက္ခဏာပြသော C-terminal ဒေသပါရှိသော αS သည် LLPS မှတစ်ဆင့် ပရိုတင်းဓာတ်ကြွယ်ဝသော အမှုန်အမွှားများကို လျှပ်စစ်ဓာတ်အငွေ့အသက်များဖြစ်သည့် pLK သို့မဟုတ် Tau ကဲ့သို့သော ဓါတ်တိုးစေသောဓာတ်ပြုမှုဖြစ်စဉ်တစ်လျှောက်တွင် ပရိုတိန်းဓာတ်ကြွယ်ဝသောအမှုန်အမွှားများဖွဲ့စည်းနိုင်သည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ပေါင်းစပ် macromolecules များ၏ရှေ့မှောက်တွင်ရှုပ်ထွေးသောငွေ့ရည်ဖွဲ့ခြင်း။αS သည် ၎င်း၏ရောဂါဆက်စပ်ပေါင်းစည်းမှုနှင့် vivo51,52,53,54 နှစ်ခုလုံးနှင့်ဆက်စပ်နေသော polycationic မော်လီကျူးများကိုတွေ့သည့် ဆဲလ်ပတ်ဝန်းကျင်တွင် သက်ဆိုင်ရာအကျိုးသက်ရောက်မှုများရှိနိုင်သည်။
လေ့လာမှုများစွာတွင် အစက်အစက်များအတွင်း ပရိုတင်းဒိုင်းနမစ်များကို ရင့်ကျက်မှုဖြစ်စဉ် 55,56 ကိုဆုံးဖြတ်သည့် အဓိကအချက်များထဲမှတစ်ခုအဖြစ် ယူဆထားသည်။electrostatic αS သည် polycations နှင့် coacervates တွင်၊ ရင့်ကျက်မှုဖြစ်စဉ်သည် polycations နှင့်အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ၏အင်အား၊ valence နှင့်ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ၏များပြားမှုပေါ်တွင်မူတည်သည်။မျှခြေသီအိုရီအရ အရည်ပြည်နယ်နှစ်ခု၏ မျှခြေအခင်းအကျင်းသည် LLPS57,58 ကိုမောင်းနှင်သည့် ဇီဝပိုလီမာများကြွယ်ဝသောအမှုန်အမွှားကြီးများရှိနေခြင်းဖြစ်မည်ဟု အကြံပြုထားသည်။Ostwald ရင့်ကျက်မှု 59၊ coalescence60 သို့မဟုတ် ပြန့်ကျဲနေသော အဆင့် 61 တွင် အခမဲ့ monomer သုံးစွဲခြင်းဖြင့် ရေစက်ကြီးထွားမှုကို ရရှိနိုင်သည်။αS နှင့် Tau441၊ ΔNt-Tau သို့မဟုတ် pLK အတွက်၊ ဤလေ့လာမှုတွင် အသုံးပြုသည့် အခြေအနေများအောက်တွင် ပရိုတင်းအများစုကို ကွန်ဒင်းဆိတ်တွင် စုစည်းထားသည်။သို့ရာတွင်၊ အရွယ်အစားပြည့်သော tauအမှုန်အမွှားများသည် မျက်နှာပြင်စိုစွတ်မှုတွင် လျင်မြန်စွာ ပေါင်းစပ်နေသော်လည်း၊ အစက်အပြောက်များ ပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် စိုစွတ်ခြင်းသည် ΔNt-Tau နှင့် pLK အတွက် ခက်ခဲပြီး ဤစနစ်နှစ်ခုရှိ အရည်ဂုဏ်သတ္တိများ လျင်မြန်စွာ ဆုံးရှုံးခြင်းကို ညွှန်ပြနေသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ FLIM-FRET ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချက်အရ၊ အသက်ကြီးသော pLK နှင့် ΔNt-Tau အစက်များသည် မူလအမှုန်အမွှားများကဲ့သို့ ပရိုတင်းစုစည်းမှု (အလားတူ မီးချောင်းများ၏ သက်တမ်းတစ်လျှောက်) ကိုပြသပြီး မူလပရိုတင်းကွန်ရက်ကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် အောက်ပါပုံစံ (ပုံ 8) တွင် ကျွန်ုပ်တို့၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်များကို ကျိုးကြောင်းဆီလျော်အောင် ချိန်ညှိပါသည်။ကနဦးတွင် ယာယီဖွဲ့စည်းထားသော အမှုန်အမွှားများသည် မကြာခဏ electrostatic လျော်ကြေးမပေးဘဲ ပရိုတင်းကွန်ရက်များဖြစ်ပြီး၊ အထူးသဖြင့် အစက်အပြောက်မျက်နှာပြင်တွင် တာဝန်ခံမှုမညီမျှမှု ဧရိယာများရှိနေကာ၊ မြင့်မားသော electrostatic မျက်နှာပြင်အလားအလာရှိသော အစက်များကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။အားလျော်ကြေးပေးခြင်း (valence depletion ဟု အများအားဖြင့် ရည်ညွှန်းသော ဖြစ်စဉ်တစ်ခု) နှင့် အစက်များ၏ မျက်နှာပြင်အလားအလာကို လျှော့ချရန်၊ အစက်အစက်များသည် အမှုန်အမွှားအဆင့်မှ polypeptides အသစ်များ ပါဝင်နိုင်သည်၊ charge-charge interactions ကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် လုပ်ဆောင်ရန် ပရိုတင်းကွန်ရက်များကို ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းနိုင်ပြီး အခြားအမှုန်အမွှားများနှင့် အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်နိုင်ပါသည်။မျက်နှာပြင်များ (စိုစွတ်ခြင်း) နှင့်။၎င်းတို့၏ ရိုးရှင်းသော ပရိုတင်း ကွန်ရက် (αS နှင့် pLK အကြား တူညီသော အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှုများ) နှင့် ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု အတွက် ပိုမို ရင်းနှီးမှု ရှိသော ကြောင့် αS/pLK အစက်များသည် ကွန်ဒွန်ဆိတ် ၏ တာဝန်ခံ ကို ပိုမို လျင်မြန်စွာ ချိန်ခွင်လျှာ ပေးနိုင်ပုံ ရသည်။အမှန်ပင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် αS/Tau ထက် အစပိုင်းတွင် ဖွဲ့စည်းထားသော αS/pLK coacervates တွင် ပိုမိုမြန်ဆန်သော ပရိုတိန်း kinetics ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။valence depletion ပြီးနောက်၊ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများသည် ပေါ်ပင်နည်းလာပြီး အမှုန်အမွှားများသည် ၎င်းတို့၏ အရည်ဂုဏ်သတ္တိများ ဆုံးရှုံးကာ electrostatic မျက်နှာပြင် ဖြစ်နိုင်ချေနည်းသော ဂျယ်ကဲ့သို့ မီးလောင်လွယ်သော အမှုန်အမွှားများအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲသွားပါသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ αS/Tau အမှုန်အမွှားများသည် ပိုမိုရှုပ်ထွေးသောပရိုတိန်းကွန်ရက်များ ( homotypic နှင့် heterotypic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများနှင့်အတူ) နှင့် ပရိုတင်းဓာတ် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှု၏ အားနည်းသောသဘောသဘာဝကြောင့် droplet charge balance ကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်လုပ်ရာတွင် ထိရောက်မှုနည်းပါသည်။၎င်းသည် အရည်အပြုအမူကို အချိန်ကြာမြင့်စွာ ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည့် အမှုန်အမွှားများကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် ကြီးထွားခြင်း (ထို့ကြောင့် အစက်များ၏ မျက်နှာပြင်ဧရိယာ/ထုထည်အချိုးကို လျှော့ချခြင်း) နှင့် hydrophilic မျက်နှာပြင်ဓာတုဆေးကို စိုစွတ်ခြင်းဖြင့် မြင့်မားသော electrostatic မျက်နှာပြင်အလားအလာကို ပြသသည်။၎င်းသည် ပရိုတိန်းကွန်ရက်အတွင်း အခကြေးငွေပိုကောင်းအောင် အဆက်မပြတ်ရှာဖွေနေသောကြောင့် အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများသည် အလွန်တိုတောင်းနေသဖြင့် ၎င်းသည် ကြီးမားသောစုစည်းထားသော ပရိုတိန်းစာကြည့်တိုက်များကို ဖန်တီးပေးပါသည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ သဘာဝအတိုင်းဖြစ်ပေါ်နေသော isoforms62 အပါအဝင် အချို့သော N-terminally ဖြတ်တောက်ထားသော ပုံစံများသည် αS နှင့် အိုမင်းရင့်ရော်မှုကို ကြာမြင့်စွာ ပေါင်းစပ်ထားသည့် gel-like အစက်များအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲစေပြီး အချို့မှာ အလယ်အလတ်အမူအကျင့်များကို ပြသသည်။αS electrostatic coacervates ၏ရင့်ကျက်မှုတွင် ဤနှစ်ထပ်သည် valence depletion နှင့် electrostatic sieving တို့၏ condensate အရွယ်အစားနှင့် အရည်ဂုဏ်သတ္တိများကို ထိန်းချုပ်ရန် သော့ချက်အဖြစ် ကွန်ဒွန်စိတ်အရွယ်အစားနှင့် အရည်ဂုဏ်သတ္တိများကို ထိန်းချုပ်ရန် သော့ချက်အဖြစ် မကြာသေးမီက LLPS သီအိုရီနှင့် စမ်းသပ်လေ့လာမှုများနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ယန္တရား ၅၈.၆၁။
ဤအစီအစဥ်သည် LLPS နှင့် LSPT မှတဆင့် αS နှင့် Tau441 အတွက် putative amyloid စုစည်းမှုလမ်းကြောင်းကို ပြသသည်။ထပ်လောင်း anion-ကြွယ်ဝသော (အနီရောင်) နှင့် cation-rich (အပြာ) ဒေသများနှင့်အတူ၊ αS နှင့် tau electrostatic coacervates များသည် ကျေနပ်ဖွယ် valence ရှိသော မျက်နှာပြင်စွမ်းအင်နည်းပါးပြီး ပေါင်းစပ်မှုနည်းသောကြောင့် အစက်အပြောက်များ လျင်မြန်စွာ အိုမင်းခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။တည်ငြိမ်သော ပေါင်းစပ်မဟုတ်သော ဂျယ်လ်ပြည်နယ်ကို ရရှိသည်။.၎င်း၏ပိုမိုရင်းနှီးမှုနှင့်ပိုမိုရိုးရှင်းသောပရိုတိန်းအတွဲအပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကွန်ရက်ကြောင့် αS/pLK စနစ်၏အမှုတွင် ဤအခြေအနေသည် အလွန်အဆင်ပြေပါသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်တွင်၊ ကျေနပ်ဖွယ်မရှိသော valence ပါသည့် အမှုန်အမွှားများနှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးပြုနိုင်သော ပရိုတင်းဓာတ်အားသွင်းသည့်ဒေသများသည် ၎င်း၏မြင့်မားသောမျက်နှာပြင်စွမ်းအင်ကိုလျှော့ချရန်အတွက် hydrophilic မျက်နှာပြင်ကို ပေါင်းစပ်ရန် ပိုမိုလွယ်ကူစေသည်။Tau-Tau နှင့် αS-Tau အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှု အားနည်းသော ဘက်စုံရှုပ်ထွေးသော ကွန်ရက်ရှိသည့် αS/Tau441 coacervates အတွက် ပိုကောင်းသည်။တစ်နည်းအားဖြင့်၊ ပိုကြီးသော coacervates များသည် ၎င်းတို့၏ အရည်နှင့်တူသော ဂုဏ်သတ္တိများကို ပိုမို လွယ်ကူစွာ ထိန်းသိမ်းထားနိုင်ပြီး အခြားသော ပရိုတိန်းမှ ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများ ဖြစ်ပေါ်နိုင်စေပါသည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ အာရုံကြောပျက်စီးမှုဆိုင်ရာရောဂါများ၏လက္ခဏာများဖြစ်သည့် inclusion body တွင်တွေ့ရှိရသောအရာများနှင့်ဆက်စပ်နိုင်သည့် coacervate အရည်အတွင်း αS နှင့် tau နှစ်မျိုးလုံးပါဝင်သော amyloid ကွဲပြားသောပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းမှုများ။
αS/Tau441 ၏ ရင့်ကျက်မှုတွင် ကြီးမားသော အရည်နှင့်တူသော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံများသည် အလွန်ကျပ်နေသော်လည်း သွက်လက်သော ပရိုတင်းပတ်ဝန်းကျင်ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားကာ အနည်းငယ်မျှသောအတိုင်းအတာအထိ၊ αS/ΔNt-Tau coacervates များသည် ပရိုတင်းများ ပေါင်းစည်းခြင်းအတွက် စံပြရေလှောင်ကန်များဖြစ်သည်။မကြာခဏ αS နှင့် tau နှစ်မျိုးလုံးပါရှိသော ဤပရိုတင်း coacervates အမျိုးအစားတွင် အစိုင်အခဲပရိုတိန်းအစုအဝေးများ ဖွဲ့စည်းခြင်းကို ကျွန်ုပ်တို့ အမှန်ပင် လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤအ heteroaggregates များသည် လျှပ်စစ်စတိတ်မဟုတ်သော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများဖြင့် တည်ငြိမ်နေကြောင်း၊ amyloid-specific ThT ဆိုးဆေးများကို ပုံမှန် amyloid fibrils များကဲ့သို့ပင် ချည်နှောင်နိုင်ပြီး၊ အမျိုးမျိုးသော လွှမ်းမိုးမှုများကို ခံနိုင်ရည်ရှိသည်မှာ အမှန်ပင်ဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသထားပါသည်။LLPS မှဖွဲ့စည်းထားသော αS/tau ပေါင်းစုများသည် amyloid နှင့်တူသောဂုဏ်သတ္တိများရှိကြောင်းပြသခဲ့သည်။အမှန်စင်စစ်၊ Tau ၏ ရင့်ကျက်သောမူကွဲသည် amyloid စုစည်းမှုတွင် ချို့တဲ့ပါက အရည် electrostatic coacervate အတွင်းရှိ ဤမျိုးကွဲကွဲပြားသော αS အစုအဝေးများဖွဲ့စည်းရာတွင် သိသိသာသာချို့ယွင်းသွားပါသည်။αS/Tau441 စုပေါင်းဖွဲ့စည်းခြင်းကို အရည်နှင့်တူသော ဂုဏ်သတ္တိများကို ထိန်းသိမ်းထားသည့် coacervates အတွင်း၌သာ တွေ့ရှိရပြီး coacervates/droplets များသည် gel အခြေအနေသို့ မရောက်ရှိပါက မည်သည့်အခါမှ မတွေ့နိုင်ပါ။နောက်ဆုံးအခြေအနေတွင်၊ electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ၏ခွန်အားတိုးလာပြီးရလဒ်အနေဖြင့်၊ ပရိုတင်းကွန်ရက်၏တောင့်တင်းမှုသည် amyloid nucleation အတွက်လိုအပ်သောပရိုတိန်းတုံ့ပြန်မှုအသစ်များတည်ဆောက်ရန်အတွက်လိုအပ်သောပုံစံတူပရိုတိန်းများ၏ပြန်လည်ပြင်ဆင်မှုများကိုတားဆီးထားသည်။သို့သော်၊ ၎င်းကို အရွယ်အစား တိုးလာသည်နှင့်အမျှ အရည်အဖြစ် ဆက်လက်တည်ရှိနိုင်ခြေ ပိုများသော ပျော့ပြောင်းသော အရည်ကဲ့သို့သော coacervates များဖြင့် ၎င်းကို ရရှိနိုင်သည်။
လျင်မြန်စွာ gel ရှိသော အမှုန်အမွှားလေးများထက် ကြီးမားသော αS/Tau condensates တွင် ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းခြင်းကို ပိုကောင်းစေပြီး၊ droplet coalescence ကို ထိန်းချုပ်သည့် အကြောင်းရင်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း၏ ဆက်စပ်မှုကို မီးမောင်းထိုးပြပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ အဆင့်ခွဲခြားရန် သဘောထားရှိရုံသာမက၊ ကွန်ဒွန်ဆိတ်၏အရွယ်အစားကို သင့်လျော်စွာလုပ်ဆောင်နိုင်သည့်အပြင် ရောဂါကာကွယ်ခြင်းအတွက် ၅၈၊၆၁ ကိုလည်း ထိန်းချုပ်ရမည်ဖြစ်သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် αS/Tau စနစ်အတွက် LLPS နှင့် LSPT ကြားချိန်ခွင်လျှာ၏အရေးပါမှုကိုလည်း မီးမောင်းထိုးပြပါသည်။အမှုန်အမွှားများဖွဲ့စည်းခြင်းသည် ရွှဲရွှဲအခြေအနေများအောက်တွင်ရရှိနိုင်သော ပရိုတင်းမိုနိုမိုနိုပမာဏကို လျှော့ချခြင်းဖြင့် amyloid ပေါင်းစပ်မှုကို ကာကွယ်ပေးနိုင်သော်လည်း အခြားသောစနစ်များ63,64 တွင် အဆိုပြုထားသည့်အတိုင်း၊ မြင့်မားသောအစက်အပြောက်အဆင့်တွင် အစက်အပြောက်ပေါင်းစပ်မှုသည် နှေးကွေးသောပုံစံပြန်လည်ပြင်ဆင်မှုများမှတစ်ဆင့် အတွင်းပိုင်းပရိုတင်းစုစည်းမှုကိုဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ပရိုတိန်းကွန်ရက်များ။.
ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် LSPT ၏အခြေအနေတွင် drop networks များတွင် စည်းလုံးညီညွှတ်သော valence နှင့် ကျေနပ်မှု/မကျေနပ်သော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ၏ဆက်စပ်မှုကို အလေးပေးပါသည်။အထူးသဖြင့်၊ အလျားပြည့် αS/Tau441 ကွန်ဒင်းနိတ်များသည် ပရိုတိန်းနှစ်မျိုးလုံးပါဝင်ပြီး ကျွန်ုပ်တို့၏စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအပေါ်အခြေခံ၍ မော်လီကျူးယန္တရားတစ်ခုတင်ပြသည့် amyloid-like heteroaggregates များအဖြစ် amyloid-like heteroaggregates များအဖြစ် ထိရောက်စွာပေါင်းစပ်ပြီး နျူကလိယလုပ်နိုင်စွမ်းရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။ဤနေရာတွင် ကျွန်ုပ်တို့အစီရင်ခံသည့် αS/Tau fluid coacervate တွင် ပရိုတင်းနှစ်ခု၏ ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်မှုသည် ရောဂါ၏အမှတ်အသားဖြစ်သည့် ပေါင်းစည်းမှုတွင် ပရိုတိန်းနှစ်ခု၏ ပူးတွဲဒေသသတ်မှတ်မှုနှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်ပြီး LLPS နှင့် LLPS အကြား ဆက်နွယ်မှုကို နားလည်ရန် အထောက်အကူဖြစ်စေနိုင်သည်။ amyloid စုစည်းမှု၊ neurodegeneration တွင် အလွန်အမင်း စွဲချက်တင်သော IDP အတွက် လမ်းခင်းပေးသည်။
Monomeric WT-αS၊ cysteine ​​​​ mutants (Q24C-αS, N122C-αS) နှင့် ΔCt-αS မျိုးကွဲများ (Δ101-140) ကို E. coli ဖြင့် ဖော်ပြပြီး ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း သန့်စင်ခဲ့သည်။5 mM DTT သည် disulfide နှောင်ကြိုးဖွဲ့စည်းခြင်းကိုကာကွယ်ရန် αS cysteine ​​​​ mutants များကိုသန့်စင်ခြင်းတွင်အဆင့်အားလုံးတွင်ထည့်သွင်းထားသည်။Tau441 isoform (Addgene #16316 မှရရှိသော plasmid)၊ ΔNt-Tau မျိုးကွဲ (Δ1–150၊ IVA ကို ပလာမာများ CTTTAAGAAGGAAGATACATATGATCGCCACACCGGG၊ CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) နှင့် Aggpurmers CTTTAAGAAGGAAGATACATATGATCGCCACACCGGG၊ CATATGTATATCCTCTCTTTTTAAAGTTAAAC) နှင့် Aggpurs-5TCACTau (3 ECGpur-5TAC) primer နှင့် Aggpure-5TCACTau . coli ယဉ်ကျေးမှုများ OD600 = 0.6–0.7 သို့ 37°C နှင့် 180 rpm တွင် ကြီးထွားလာပြီး ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုကို 37°C တွင် 3 နာရီကြာ IPTG ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ဆဲလ်များကို 11,500 xg တွင် 4°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ ရိတ်သိမ်းပြီး 150 mM NaCl ပါဝင်သော ဆားရည်ကြားခံဖြင့် ဆေးကြောပါ။အမှုန်အမွှားအား lysis ကြားခံတွင် (1 LB လျှင် 20 ml- MES 20 mM၊ pH 6.8၊ NaCl 500 mM၊ EDTA 1 mM၊ MgCl2 0.2 mM၊ DTT 5 mM၊ PMSF 1 mM၊ benzamidine 50 μtinM)၊sonication အဆင့်ကို 10 ပဲမျိုးစုံအတွက် amplitude 80% ဖြင့် ရေခဲပြင်ပေါ်တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (1 မိနစ်တွင်၊ 1 မိနစ်ပိတ်သည်)။အာထရာဆောင်းတစ်ခုတွင် 60 ml ထက်မပိုပါနှင့်။E. coli lysates ကို 95°C တွင် မိနစ် 20 ကြာ အပူပေးပြီး ရေခဲပေါ်တွင် အအေးခံကာ 127,000×g တွင် မိနစ် 40 ကြာ centrifuged ပေးသည်။ရှင်းလင်းထားသော supernatant ကို 3.5 kDa အမြှေးပါး (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific၊ UK) တွင် အသုံးချပြီး 4 L dialysis ကြားခံ (20 mM MES၊ pH 6.8၊ NaCl 50 mM၊ EDTA 1 mM၊ MgCl2 2 mM၊ DTT , PMSF 0.1 mM) 10 နာရီ။5 ml cation လဲလှယ်သည့်ကော်လံ (HiTrap SPFF၊ Cytiva, MA, USA) ကို မျှခြေကြားခံကြားခံ (20 mM MES၊ pH 6.8၊ 50 mM NaCl၊ 1 mM EDTA၊ 2 mM MgCl2၊ 2 mM DTT၊ SF) 0.1 mM။tau lysate ကို 0.22 μm PVDF ဇကာဖြင့် စစ်ထုတ်ပြီး 1 ml/min ဖြင့် ကော်လံထဲသို့ ထိုးသွင်းသည်။Elution ကို တဖြည်းဖြည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး၊ tau ကို 15-30% elution ကြားခံ (20 mM MES၊ pH 6.8၊ 1 M NaCl၊ 1 mM EDTA၊ 2 mM MgCl2၊ 2 mM DTT၊ 0.1 mM PMSF) ဖြင့် ဖယ်ထုတ်ထားသည်။အပိုင်းအစများကို SDS-PAGE မှ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး tau မျှော်မှန်းထားသည့် မော်လီကျူးအလေးချိန်နှင့် တီးဝိုင်းတစ်ခုပါရှိသော မည်သည့်အပိုင်းများကိုမဆို 10 kDa centrifuge filter ဖြင့် စုစည်းပြီး 10 mM HEPES၊ pH 7.4၊ NaCl 500 mM နှင့် DTT 2 mM ပါဝင်သော ကြားခံတစ်ခုဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ နောက်ဆုံး ပရိုတင်း အာရုံစူးစိုက်မှုသည် 100 μM ဖြစ်သည်။ထို့နောက် ပရိုတင်းဖြေရှင်းချက်အား 0.22 μm PVDF စစ်ထုတ်မှုမှတစ်ဆင့် ဖြတ်သွားကာ လျှင်မြန်စွာ အေးခဲပြီး -80°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ပရိုတင်း K18 ကို ပရော်ဖက်ဆာ Alberto Boffi မှ ကြင်နာစွာ ပံ့ပိုးပေးပါသည်။SDS-PAGE နှင့် MALDI-TOF/TOF တို့မှ အတည်ပြုထားသည့်အတိုင်း ပြင်ဆင်မှု၏ သန့်ရှင်းမှုသည် > 95% ဖြစ်သည်။အမျိုးမျိုးသော cysteine ​​များကို AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) သို့မဟုတ် TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada) ဖြင့် တံဆိပ်ကပ်ထားသည်။စုပ်ယူမှုနှင့် MALDI-TOF/TOF တို့က အတည်ပြုခဲ့သည်။Tau441၊ ΔNt-Tau၊ AggDef-Tau နှင့် K18 တို့ကို Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ကို အသုံးပြု၍ ရာထူး 191 နှင့် 322 တွင် မူရင်း cysteine ​​အကြွင်းအကျန်များဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသည်။αS နှင့် Tau441 အတွက် အကြွင်းမြေပုံတစ်ခုလျှင် အသားတင် အခကြေးငွေကို CIDER66 ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်ပေးပါသည်။
ပေးသွင်းသူထံမှ NMR အဆိုအရ အစိုင်အခဲ poly-L-lysine (pLK DP 90-110၊ Alamanda Polymers Inc၊ Huntsville၊ Alabama၊ USA) တွင် 10 mM HEPES၊ 100 mM NaCl၊ pH 7.4 မှ 10 mM ပြင်းအား၊ လုပ်ငန်းစဉ် 5 အတွက် sonicated ultrasonic ရေချိုးပြီး မိနစ်-20 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် သိမ်းဆည်းပါ။PEG-8၊ dextran-70၊ FITC-PEG-10 (Biochempeg၊ Watertown, MA, USA) နှင့် FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) တို့သည် ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်ပြီး LLPS ကြားခံတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ဖြန့်ဝေပါသည်။Dialysis သည် ညစ်ညမ်းသော ဆားများကို ဖယ်ရှားပေးသည်။ထို့နောက် ၎င်းတို့အား 0.22 µm ရှိသော ချွေးပေါက်အရွယ်အစားရှိသော ပြွတ်ပြဇကာဖြင့် စစ်ထုတ်ကာ ၎င်းတို့၏ ပြင်းအားကို refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA) ဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်။LLPS နမူနာများကို အောက်ပါအစီအစဉ်အတိုင်း အခန်းအပူချိန်တွင် ပြင်ဆင်ခဲ့သည်- ကြားခံနှင့် ထုတ်ယူခြင်းကို ရောစပ်ပြီး 1 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) နှင့် 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) ၏ အရောအနှော။ထို့နောက် αS နှင့် ပေါင်းစပ် polycations (ရွေးချယ်စရာများ pLK သို့မဟုတ် Tau) ကို ပေါင်းထည့်သည်။thioflavin-T အချိန်စီးရီးစမ်းသပ်မှုများ (ThT၊ Carbosynth၊ Compton၊ UK) အတွက် စုစုပေါင်း ThT အာရုံစူးစိုက်မှုကို αS ထက်ဝက်အဖြစ် အသုံးပြုပါ။နမူနာများကို တစ်သားတည်းဖြစ်ရန် သေချာစေရန် ညင်သာစွာ နှိုက်နှိုက်ချွတ်ချွတ် ရောမွှေပါ။အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုစီ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် ရလဒ်များကဏ္ဍတွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း စမ်းသပ်မှုတစ်ခုမှ စမ်းသပ်မှုတစ်ခုသို့ ကွဲပြားသည်။စမ်းသပ်မှု၏ကြာချိန် 4 နာရီကျော်လွန်သည့်အခါတိုင်း Azide ကို 0.02% (w/v) တွင်အသုံးပြုခဲ့သည်။LLPS နမူနာများကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးအတွက်၊ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီ 5 မိနစ်ခန့်အရောအနှောကို ညီမျှအောင်ခွင့်ပြုပါ။အလင်းခွဲဝေမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ နမူနာ 150 µl ကို စည်းနှောင်ခြင်းမရှိသော 96-ကောင်းစွာ မိုက်ခရိုပလိတ်များ (µClear®၊ အနက်ရောင်၊ F-Bottom/Chimney Well၊ Greiner bio-one၊ Kremsmünster၊ Austria) ပေါ်တွင် တင်ဆောင်ပြီး ကော်ဖလင်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသည်။LLP များကို CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) တွင် အဖြေ၏အလယ်ဗဟိုတွင် 350 nm တွင် စုပ်ယူမှုကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှုများကို 25°C တွင် triplicate ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး အမှားများကို ပျမ်းမျှမှ စံသွေဖည်မှုအဖြစ် တွက်ချက်ခဲ့သည်။dilute အဆင့်ကို နမူနာ centrifugation နှင့် SDS-PAGE gel ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် တိုင်းတာခဲ့ပြီး၊ မှေးမှိန်ပြီး စုစည်းထားသော အဆင့်များရှိ αS အပိုင်းအစများကို LLPS ဖြေရှင်းချက်အမျိုးမျိုးတွင် တိုင်းတာပါသည်။1 μM AF488-တံဆိပ်တပ်ထားသော αS ပါ၀င်သော 100 μl LLPS နမူနာကို နှံ့နှံ့စပ်စပ်ရောစပ်ပြီးနောက် မိနစ် 30 ကြာ 9600 × g တွင် centrifugation ဖြင့်ပြင်ဆင်ခဲ့ပြီး၊ ထို့နောက်တွင် မိုးရွာသွန်းမှုကို အများအားဖြင့်မြင်နိုင်သည်။supernatant ၏ ထိပ်တန်း 50 μl ကို SDS-PAGE ဂျယ်ကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းပမာဏအတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ChemiDoc gel ပုံရိပ်ဖော်စနစ် (Bio-Rad ဓာတ်ခွဲခန်း၊ Hercules၊ CA၊ USA) ကို အသုံးပြု၍ AF488 စစ်ထုတ်မှုများဖြင့် စကင်န်ဖတ်ခြင်း သို့မဟုတ် Coomassie အစွန်းအထင်းဖြင့် စွန်းထင်းပြီး သင့်လျော်သော စစ်ထုတ်မှုများဖြင့် မြင်သာအောင် ပြုလုပ်ထားပါသည်။ရလဒ်များကို ImageJ ဗားရှင်း 1.53i (National Institutes of Health, USA) သုံးပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှုများကို တူညီသောရလဒ်များဖြင့် မတူညီသော စမ်းသပ်မှုနှစ်ခုတွင် ထပ်တူပြုလုပ်ခဲ့သည်။
ပုံမှန်အားဖြင့်၊ နမူနာများ 150 μl ကို ချည်နှောင်ခြင်းမရှိသော 96-well မိုက်ခရိုပလိတ်များထံ အသုံးချပြီး Leica DMI6000B ပြောင်းပြန်အဏုကြည့်မှန်ပြောင်း (Leica Microsystems၊ Wetzlar၊ Germany) တွင် အခန်းအပူချိန်တွင် မြင်သာထင်သာမြင်သာသည်။အစက်အပြောက်စမ်းသပ်မှုများအတွက် µ-Slide Angiogenesis plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) သို့မဟုတ် 96- well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ကိုလည်း အသုံးပြုခဲ့သည်။EL6000 ဟေလိုဂျင် သို့မဟုတ် ပြဒါးသတ္တု halide မီးချောင်းများကို အလင်းရောင်ရင်းမြစ်များ (BF/DIC နှင့် WF ပုံရိပ်များအတွက် အသီးသီး) အသုံးပြုခဲ့သည်။WF အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းအတွက်၊ 40x ချဲ့ထွင်ထားသော လေထုရည်မှန်းချက် (Leica Microsystems၊ Germany) ကို နမူနာပေါ်တွင် အလင်းကို အာရုံစိုက်ပြီး ၎င်းကို စုဆောင်းရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။AF488 နှင့် ThT တံဆိပ်တပ်ထားသောနမူနာများအတွက်၊ ပုံမှန် GFP စစ်ထုတ်မှုအစုံများ၊ စိတ်လှုပ်ရှားမှုနှင့် ထုတ်လွှတ်မှု bandpass စစ်ထုတ်မှုများ၊ အသီးသီး၊ 460–500 nm နှင့် 512–542 nm bandpass စစ်ထုတ်မှုများနှင့် 495 nm dichroic မှန်များဖြင့် စစ်ထုတ်ပါ။Atto647N ဖြင့်တံဆိပ်တပ်ထားသောနမူနာများအတွက်၊ စိတ်လှုပ်ရှားမှုနှင့်ထုတ်လွှတ်မှု bandpass စစ်ထုတ်မှုများပါရှိသော Cy5 စစ်ထုတ်မှုများ 628–40 nm နှင့် 692–40 nm အသီးသီးနှင့် 660 nm dichroic mirror ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။BF နှင့် DIC မိုက်ခရိုစကုပ်အတွက်၊ တူညီသောရောင်ပြန်ဟပ်သောအလင်းစုဆောင်းမှုရည်မှန်းချက်ကိုအသုံးပြုပါ။စုဆောင်းထားသောအလင်းအား Leica DFC7000 CCD ကင်မရာ (Leica Microsystems၊ Germany) တွင် မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။အလင်းဝင်ချိန်သည် BF နှင့် DIC အဏုကြည့်ခြင်းအတွက် 50 ms နှင့် WF မိုက်ခရိုစကုပ်ပုံရိပ်အတွက် 20-100 ms ဖြစ်သည်။နှိုင်းယှဉ်ရန်အတွက် ThT နှင့် စမ်းသပ်မှုအားလုံးအတွက် အလင်းဝင်ချိန်သည် 100 ms ဖြစ်သည်။ပုံများကို 100 ms တိုင်း မိနစ်အတော်ကြာ စုဆောင်းပြီး အစက်အပြောက် ပေါင်းစပ်မှုကို မြင်ယောင်နိုင်ရန် Time-lapse စမ်းသပ်မှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ImageJ (NIH, USA) ကို ရုပ်ပုံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှုများကို တူညီသောရလဒ်များဖြင့် triplicate ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
colocalization စမ်းသပ်မှုများ၊ FRAP နှင့် 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်မှုများအတွက်၊ ZEN 2 အပြာရောင်ထုတ်ဝေမှု (Carl Zeiss AG၊ Oberkochen၊ Germany) ကို အသုံးပြု၍ Zeiss LSM 880 ပြောင်းပြန်အဖုံးအကာအဏုစကုပ်ပေါ်တွင် ပုံများကို ရယူခဲ့သည်။50 µl နမူနာများကို µ-Slide Angiogenesis Petri ဟင်းလျာများ (Ibidi GmbH၊ Gröfelfing၊ Germany) တွင် ဟိုက်ဒရိုဖီလစ်ပိုလီမာ (ibiTreat) ဖြင့် ကုသပြီး 63× ရေနံနှစ်မြှုပ်ခြင်းရည်ရွယ်ချက် (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 ဆီ) တွင် တပ်ဆင်ထားသည်။ DIC တွင်)။ရုပ်ပုံများကို 458 nm, 488 nm, နှင့် 633 nm အာဂွန်လေဆာလိုင်းများ အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့သည် ThT၊ AF488 နှင့် Atto647N တို့ကို မြင်ယောင်ရန် 638–755 nm ကို အသုံးပြုထားသည်။FRAP စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ နမူနာတစ်ခုစီ၏ time-lapse ဓာတ်ပုံကို တစ်စက္ကန့်လျှင် 1 frame ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။စမ်းသပ်မှုများကို အခန်းအပူချိန်တွင် သုံးဆဖြင့် အလားတူရလဒ်များ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ပုံအားလုံးကို Zen 2 blue edition software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) ဖြင့် ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာထားပါသည်။FRAP မျဉ်းကွေးများကို OriginPro 9.1 ကို အသုံးပြု၍ Zen 2 ကို အသုံးပြု၍ ပုံများမှ ထုတ်နုတ်ထားသော ပြင်းထန်မှု/အချိန်ဒေတာနှင့် ကိုက်ညီမှုရှိသည်။ပြန်လည်ရယူခြင်းဆိုင်ရာ မျဉ်းကွေးများကို အရောင်ချွတ်ခြင်းအကျိုးသက်ရောက်မှုအတွက် ထည့်သွင်းရန်အတွက် မော်လီကျူးပျံ့နှံ့မှုအား အပိုထပ်ကိန်းအသုံးအနှုန်းဖြင့် ထည့်သွင်းတွက်ချက်ရန် မိုနို- exponential မော်ဒယ်တွင် တပ်ဆင်ထားသည်။ထို့နောက် Kang et al ၏ညီမျှခြင်းတွင်ရှိသကဲ့သို့ ယခင်သတ်မှတ်ထားသော ပြန်လည်ရယူခြင်းတစ်ဝက်ဘဝအား အမည်ခံအရောင်ချွတ်ခြင်းအချင်းဝက်ကို အသုံးပြု၍ D ကို တွက်ချက်ပါသည်။၅း၃၅။
αS ၏တစ်ခုတည်းသော cysteine ​​မျိုးကွဲများကို 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) နှင့် ရာထူး 24 (TEMPOL-24-αS) နှင့် 122 (TEMPOL-122-αS) တွင် ပေါင်းစပ်ထားပါသည်။ အသီးသီး။Spin Labeling EPR စမ်းသပ်မှုများအတွက် αS အာရုံစူးစိုက်မှုကို 100 μM တွင်သတ်မှတ်ထားပြီး PEG အာရုံစူးစိုက်မှုမှာ 15% (w/v) ဖြစ်သည်။ပေါင်းစည်းမှုအခြေအနေအမျိုးမျိုးအတွက် αS:pLK အချိုးသည် 1:10 ဖြစ်ပြီး αS:ΔNt-Tau နှင့် αS:Tau441 အချိုးများကို 1:1 တွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။လူစုလူဝေးမရှိချိန်တွင် စည်းနှောင်ထားသော titration စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ TEMPOL-122-αS ကို 50 μM တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး အခြေအနေတစ်ခုစီကို သီးခြားစီပြင်ဆင်ကာ ပိုလီကေရှင်းများကို တိုးများလာသောအခါတွင် titration လုပ်ထားသည်။CW-EPR တိုင်းတာမှုများကို Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer ကို အသုံးပြု၍ Bruker ER4118 SPT-N1 resonator သည် မိုက်ခရိုဝေ့ဖ် (SHF) ကြိမ်နှုန်း ~ 9.7 GHz တွင် လည်ပတ်နေပါသည်။အပူချိန် 25 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် သတ်မှတ်ထားပြီး နိုက်ထရိုဂျင်အရည်ကို ခရီယိုစတက်ဖြင့် ထိန်းချုပ်ထားသည်။spectra ကို မပြည့်မပြည့်အခြေအနေအောက်တွင် 4 mW ပါဝါ၊ modulation amplitude 0.1 mT နှင့် modulation frequency 100 kHz တို့ဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။Tau441 သို့မဟုတ် ΔNt-Tau (မူရင်းပရိုတိန်းဖြေရှင်းချက်များတွင် ပါရှိသည်) ပါ၀င်သော နမူနာများတွင် ကျန်ရှိသော လျှော့ချအေးဂျင့်များ၏ ကျန်ရှိသောပါဝင်မှုများကြောင့် နမူနာများကြားရှိ လှည့်ဖျားမှုပြင်းအားများနှင့် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော လှည့်ဖျားမှုလျော့ချခြင်းတို့ကို ရှောင်ရှားရန် Spectral ပြင်းအားများကို ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားပါသည်။Matlab®67 တွင်အကောင်အထည်ဖော်ထားသော Easyspin software (v. 6.0.0-dev.34) ကိုအသုံးပြု၍ EPR ရောင်စဉ်ပုံစံထုတ်ခြင်း၏ရလဒ်အနေဖြင့် g ၏တန်ဖိုးများကိုရရှိခဲ့သည်။ဒေတာကို စံနမူနာပြုရန်အတွက် အစိတ်အပိုင်းတစ်ခု/နှစ်ခု isotropic မော်ဒယ်များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။အချက်ပြမှုများအားလုံးကို ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ အကြွင်းအကျန်များကို သက်ဆိုင်ရာစမ်းသပ်ရပ်ဝန်းမှ သရုပ်ဖော်မှုတစ်ခုစီကို နုတ်ခြင်းဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်။binding titration ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက်၊ ပုံမှန်လုပ်ဆောင်ထားသော EPR spectrum (IIII/III) ၏ တတိယတီးဝိုင်းနှင့် αS နှင့် polycations ပေါင်းစပ်မှုကို စောင့်ကြည့်ရန် အသုံးပြုထားသည်။dissociation constant (Kd) ကို ခန့်မှန်းရန်၊ ရလဒ်မျဉ်းကွေးကို n တူညီပြီး အမှီအခိုကင်းသော binding sites များဟု ယူဆသည့် အနီးစပ်ဆုံး မော်ဒယ်အတွက် တပ်ဆင်ထားသည်။
NMR spectroscopy စမ်းသပ်မှုများကို Cryoprobe နှင့် Z-gradient တပ်ဆင်ထားသော Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှုအားလုံးကို 130–207 µM αS နှင့် 10 mM HEPES၊ 100 mM NaCl၊ 10% DO၊ pH 7.4 တွင် သက်ဆိုင်ရာ αS/ΔNt-Tau နှင့် pLK equivalents များကို အသုံးပြုပြီး 15°C တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။NMR ဖြင့် LPS ကို စောင့်ကြည့်ရန် 10% PEG ကို ကြိုတင်ရောစပ်ထားသော နမူနာများသို့ ထည့်ထားသည်။ဓာတုပြောင်းလဲမှု အနှောက်အယှက်ဖြစ်မှု ကြံစည်မှု (ပုံ။ 1b) သည် ပျမ်းမျှ 1H နှင့် 15N ဓာတုပြောင်းလဲမှုများကို ပြသသည်။αS 2D1H-15N HSQC ရောင်စဉ်တန်းကို ယခင်တာဝန်တစ်ခု (BMRB ဝင်ခွင့် #25227) အပေါ် အခြေခံ၍ သတ်မှတ်ပေးထားပြီး HNCA၊ HNCO နှင့် CBCAcoNH ၏ 3D ရောင်စဉ်ကို မှတ်တမ်းတင်ပြီး ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။13Cα နှင့် 13Cβ ဓာတုအပြောင်းအရွှေ့များကို ΔNt-Tau သို့မဟုတ် pLK ၏ရှေ့မှောက်တွင် တွက်ချက်ထားပြီး ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံလမ်းကြောင်းများတွင် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသောပြောင်းလဲမှုများကို တိုင်းတာရန်အတွက် αS ဓာတုအပြောင်းအလဲများကို စင်ကျပန်းကွိုင်ပုံစံ 68 (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5c) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသည်။R1ρ နှုန်းများကို hsqctretf3gpsi စမ်းသပ်မှုများ (Bruker စာကြည့်တိုက်မှ ရရှိသည်) ကို 8၊ 36၊ 76၊ 100၊ 156၊ 250၊ 400 နှင့် 800 ms နှောင့်နှေးမှုများဖြင့် တိုင်းတာပြီး ကိန်းဂဏန်းလုပ်ဆောင်ချက်များကို အထွတ်အထိပ် နှောင့်နှေးမှုသို့ ချိန်ညှိထားသည်။ R1ρ နှင့် ၎င်း၏ စမ်းသပ်မှု မသေချာမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် အချိန်များ။
ရောင်စုံအချိန်-ဖြေရှင်းထားသော မီးချောင်းအဏုကြည့်အဏုကြည့်စမ်းသပ်မှုများကို အချိန်နှင့်ညီညွှတ်သော MT200 မီးချောင်းကွန်ဖိုအဏုစကုပ် (PicoQuant၊ ဘာလင်၊ ဂျာမနီ) တွင် အချိန်နှင့်ဆက်စပ်သော ဖိုတွန်ရေတွက်ခြင်း (TCSPC) ကိရိယာဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။လေဆာ diode ဦးခေါင်းအား pulsed interleaved excitation (PIE)၊ အလင်းတန်းသည် single mode waveguide မှတဆင့်ဖြတ်သန်းပြီး dichroic mirror ပြီးနောက် တိုင်းတာသည့် 481 nm နှင့် 637 nm အတွက် လေဆာပါဝါ 10 မှ 100 nW သို့ ချိန်ညှိထားသည်။၎င်းသည် ဖိုတွန်အယောင်ဆောင်ခြင်း၊ ဓာတ်ပုံချွတ်ခြင်းနှင့် ရွှဲခြင်း၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ရှောင်ရှားခြင်းဖြင့် အကောင်းဆုံး ဖိုတွန်ရေတွက်မှုနှုန်းကို သေချာစေသည်။μ-Slide angiogenesis အဖုံးများ သို့မဟုတ် ပြားများ (Ibidi GmbH၊ Gräfelfing၊ Germany) ကို ပြုပြင်ထားသောကော်လာပါသော Super Apochromat 60x NA 1.2 မှန်ဘီလူးပေါ်မှ ရေနှစ်မြှုပ်ထားသော ရေထဲတွင် တိုက်ရိုက်ထည့်ထားသည် (Olympus Life Sciences, Waltham, USA)။488/640 nm dichroic မှန် (Semrock၊ Lake Forest, IL, USA) ကို ပင်မအလင်းတန်းခွဲခြမ်းအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။Unfocused radiation ကို အချင်း 50 microns ရှိသော အပေါက်တစ်ခုဖြင့် ပိတ်ဆို့ထားပြီး၊ ထို့နောက် focused radiation ကို 50/50 beam splitter ဖြင့် ထောက်လှမ်းမှုလမ်းကြောင်း 2 ခုသို့ ပိုင်းခြားထားသည်။အစိမ်းရောင်ဆိုးဆေး (AF488) အတွက် Bandpass ထုတ်လွှတ်မှု စစ်ထုတ်ခြင်း (Semrock၊ Lake Forest၊ IL, USA) 520/35 နှင့် အနီရောင်ဆိုးဆေး (Atto647N) အတွက် 690/70 ကို detector ရှေ့တွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။Single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices၊ Bolzano၊ Italy) ကို detectors အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ဒေတာစုဆောင်းခြင်းနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း နှစ်ခုစလုံးသည် စီးပွားဖြစ်ရနိုင်သော SymphoTime64 ဆော့ဖ်ဝဲ (PicoQuant GmbH၊ ဘာလင်၊ ဂျာမနီ) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
LLPS နမူနာများကို μ-Slide angiogenesis ရေတွင်းများ (Ibidi GmbH၊ Gräfelfing၊ Germany) တွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။ဆိုင်းငံ့ထားသော အမှုန်အမွှားများအတွက် အကောင်းဆုံး ရည်မှန်းချက် အလုပ်အကွာအဝေးအတွက် အကောင်းဆုံး ရည်ရွယ်ချက်အတွက် ရလဒ်ထွက်ပုံများကို ရေတွင်းအောက်ခြေမှ 20 µm နှင့် ဖောင်များနှင့် အစက်များအတွက် ~1 µm သို့ အာရုံစူးစိုက်ထားပြီး axial resolution အနည်းဆုံး 0.25 µm/pixel နှင့် နှောင့်နှေးချိန် 400 µs/pixel ။ချန်နယ်တစ်ခုစီအတွက် ပျမ်းမျှနောက်ခံအချက်ပြပြင်းထန်မှု (PBG၊ mean + 2σ) ပေါ်မူတည်၍ ပြင်းထန်မှုအတိုင်းအတာတစ်ခုစီကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ဒေတာကိုရွေးချယ်ပြီး ကွဲကွာသွားသည့်အဆင့်မှ ဖြစ်နိုင်သည့်ဇာစ်မြစ်ကို စစ်ထုတ်ရန်အတွက် ပရိုတင်းအမှုန်အမွှားများ၊ ဖောင်များ သို့မဟုတ် အစက်အပြောက်များကိုသာ ရွေးချယ်ပါ။ချန်နယ်တစ်ခုစီ၏ မျိုးစိတ်တစ်ခုစီ (τ) ၏ သက်တမ်းကို ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာရန် (စိမ်း၊ )8b) ၎င်းတို့အား ၎င်းတို့၏ တစ်သက်တာ ပျက်စီးယိုယွင်းမှု (τD၊ τR နှင့် τP အစက်အပြောက်များ၊ ဖောင်များ သို့မဟုတ် အစက်အပြောက်များအတွက် အသီးသီး၊ နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 8c ကို ကြည့်ပါ) ချန်နယ်တစ်ခုစီရှိ အမြီး-အံကိုက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် အစိတ်အပိုင်းနှစ်ခုပါသော ပျက်စီးယိုယွင်းမှုပုံစံကို အသုံးပြု၍ ချန်နယ်တစ်ခုစီတွင် ၎င်းတို့ကို ဖြည့်ဆည်းပေးသည်။τ မှ ပျမ်းမျှ။ကိန်းဂဏန်းပေါင်းများစွာ ကိုက်ညီမှုအတွက် ဖိုတွန်အနည်းငယ်သာ ထုတ်လုပ်သည့် ROI များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ ဖယ်ထုတ်ထားသည်။ဖောင်များနှင့် အစက်များအတွက် ဖိုတွန် <104 နှင့် အစက်များအတွက် 103 ကို အသုံးပြုထားသည်။ပုံအကွက်ရှိ အစက်များသည် အများအားဖြင့် သေးငယ်ပြီး အရေအတွက်နည်းသောကြောင့် အစက်များသည် ပြင်းထန်မှုတန်ဖိုးများ ပိုမိုမြင့်မားသော ပျက်စီးယိုယွင်းနေသောမျဉ်းကွေးများကို ရရှိရန် ခက်ခဲသောကြောင့် အမှုန်အမွှားများသည် အနိမ့်ပိုင်းရှိသည်။ဖိုတွန်စုဆောင်းမှုကန့်သတ်ချက်အထက်တွင် ဖိုတွန်အရေအတွက် ROI များ (အရေအတွက် 500/pixel သို့သတ်မှတ်ထားသည်) ကိုလည်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် ဖယ်ထားခဲ့သည်။ပြင်းထန်မှု ယိုယွင်းမှုအားလုံးအတွက် တူညီကြောင်းထိန်းသိမ်းထားစဉ်တွင် IRF စွက်ဖက်မှုအားလုံးအတွက် တူညီကြောင်းထိန်းသိမ်းထားစဉ် ပြင်းထန်မှုအားလုံးအတွက် တူညီကြောင်းသေချာစေရန် ဝန်ဆောင်မှုသက်တမ်းအစမှ (ပျက်စီးခြင်း၏အမြင့်ဆုံးပြင်းထန်မှုအနည်းငယ်အကြာတွင် အနည်းငယ်အကြာတွင်) စိတ်ဝင်စားသည့်ဒေသမှရရှိသော ပြင်းထန်မှုပျက်စီးမှုမျဉ်းကွေးကို အမြင့်ဆုံး 90% တွင် ယှဉ်တွဲပါ ဆက်တင်များ ဆွေမျိုးအချိန်ပြတင်းပေါက် ဖောင်များနှင့် အစက်အပြောက်များအတွက် 25 မှ 50 ROI ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး အစက်အပြောက်များအတွက် 15-25 ROI၊ အနည်းဆုံး သီးခြားစမ်းသပ်ချက် 3 ခုမှ မှတ်တမ်းတင်ထားသော ပုံတူပွား 4 ခုထက်ပိုသော ပုံများကို ရွေးချယ်ထားသည်။မျိုးစိတ်များကြား သို့မဟုတ် coacervate စနစ်များကြားတွင် စာရင်းအင်းဆိုင်ရာ ကွဲပြားမှုများကို အကဲဖြတ်ရန် အမြီးနှစ်ကြောင်းရှိသော t-test ကို အသုံးပြုထားသည်။တစ်သက်တာ (τ) ၏ pixel-by-pixel ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတစ်ခုအတွက်၊ ချန်နယ်တစ်ခုစီအတွက် အကွက်တစ်ခုစီအတွက် သက်တမ်းတစ်လျှောက်လုံး၏ သက်တမ်းတစ်လျှောက်လုံးအား လျော့ချခြင်းကို တွက်ချက်ပြီး 2/3-component exponential attenuation model ကို အနီးစပ်ဆုံးလုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ထို့နောက် ပစ်ဇယ်တစ်ခုစီအတွက် တစ်သက်တာလျော့ချမှုကို ယခင်တွက်ချက်ထားသော τ တန်ဖိုးများကို အသုံးပြုကာ တပ်ဆင်ခဲ့ပြီး၊ ရလဒ်အဖြစ် pseudocolor FLIM နှင့် အံဝင်ခွင်ကျရှိသော ရုပ်ပုံတစ်ပုံဖြစ်လာသည်။အမြီး-အံကိုက် တစ်သက်တာအကွာအဝေးသည် တူညီသောချန်နယ်ရှိ ပုံများအားလုံးတွင် တူညီပြီး ပျက်စီးယိုယွင်းမှုတစ်ခုစီသည် ယုံကြည်စိတ်ချရသော အံဝင်ခွင်ကျဖြစ်ရန် လုံလောက်သော ဖိုတွန်များကို ထုတ်လုပ်ပေးသည်။FRET ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ ပျမ်းမျှ ဖိုတွန် 11 ဖိုတွန် (FBG) ၏ နောက်ခံအချက်ပြမှု (FBG) ကို ပျမ်းမျှအားဖြင့် ဖိုတွန် 100 ၏ အနိမ့်ပိုင်းပြင်းထန်မှုအဆင့်ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် pixels ကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ချန်နယ်တစ်ခုစီ၏ အလင်းရောင်ပြင်းအားကို စမ်းသပ်ဆုံးဖြတ်ထားသော အမှားပြင်ဆင်မှုဆိုင်ရာအချက်များဖြင့် ပြုပြင်ခဲ့သည်- 69 ရောင်စဉ်တန်းမျဥ်း crosstalk α သည် 0.004၊ တိုက်ရိုက် excitation β သည် 0.0305၊ ထောက်လှမ်းမှုထိရောက်မှု γ 0.517 ဖြစ်သည်။ထို့နောက် pixel အဆင့်ရှိ FRET ထိရောက်မှုကို အောက်ပါညီမျှခြင်းဖြင့် တွက်ချက်သည်-
FDD သည် အလှူရှင် (အစိမ်း) ချန်နယ်တွင် တွေ့ရှိရသော အလင်းရောင်ပြင်းအားဖြစ်ပြီး၊ FDA သည် သွယ်ဝိုက်လှုံ့ဆော်မှုအောက်ရှိ လက်ခံသူ (အနီရောင်) ချန်နယ်တွင် တွေ့ရှိရသော အလင်းရောင်ပြင်းအားဖြစ်ပြီး FAA သည် လက်ခံသူ (အနီရောင်) ချန်နယ်တွင် တွေ့ရှိရသော မီးချောင်းပြင်းထန်မှု ( PIE)။အလင်းတန်းပြင်းအား ပဲမျိုးစုံများကို ချန်နယ်တွင် တွေ့ရှိရသည်)။
WF မှ ကော်ပီကပ်ခြင်းမရှိသော သတ္တုပြားအလွှာနှင့် အစက်အစက်များဖွဲ့စည်းခြင်းတို့ကို စစ်ဆေးပြီးနောက် 25 µM monomeric Tau441 (25 µM αS) ပါရှိသော LLPS တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်၏ 100 µl ၏ LLPS တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်များအား LLPS ကြားခံ (အထက်ဖော်ပြပါအတိုင်း ဖြည့်စွက်ထားသည်) တွင် နေရာချပါ။ ညီမျှခြင်း10 မိနစ်အတွင်း။အခန်းအပူချိန်တွင် ၄၈ နာရီကြာ ပေါက်ဖွားပြီးနောက်၊ ပရိုတင်းဖောင်များနှင့် အစက်အပြောက်များ ရှိနေကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ထို့နောက် ရေတွင်းများမှ ဖောင်များပေါ်မှ အရည်များကို ဂရုတစိုက် ဖယ်ရှားပြီး 50 L dissociation buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ထည့်ပြီး 10 မိနစ်ကြာ ပျိုးထောင်ပါ။မြင့်မားသောဆားပြင်းအားသည် ကျန်နေသော PEG ကြောင့် LLPS ပြန်မဖြစ်စေရန်သေချာစေပြီး၊ electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများဖြင့်သာဖွဲ့စည်းထားသောဖြစ်နိုင်သောပရိုတိန်းစုဝေးမှုများကိုဖယ်ရှားမည်ဖြစ်သည်။ထို့နောက် ရေတွင်း၏အောက်ခြေကို မိုက်ခရိုပီပက်အစွန်အဖျားတစ်ခုဖြင့် ဂရုတစိုက် ခြစ်ထုတ်ပြီး ရလဒ်အဖြေကို အလွတ်လေ့လာရေးတွင်းသို့ လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။50 μM ThT ဖြင့် နမူနာများကို ၁ နာရီကြာ ပေါက်ဖွားပြီးနောက်၊ သီးခြားအစက်အပြောက်များ ရှိနေခြင်းကို WF အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။pH 7.4 ရှိသော PBS တွင် 70-µM αS ဖြေရှင်းချက် 300 µl၊ ဆိုဒီယမ် azide 0.01% တွင် 37°C နှင့် 200 rpm ကို ပတ်လမ်းကြောင်း shaker တွင် 7 ရက်ကြာ ဖုတ်ခြင်းဖြင့် sonicated αS fibrils ကိုပြင်ဆင်ပါ။ထို့နောက် ဖြေရှင်းချက်အား 9600×g တွင် 30 မိနစ်ကြာ အာရုံစူးစိုက်ထားပြီး၊ PBS pH 7.4 တွင် ခဲလုံးအား ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီး sonicated (1 မိနစ်၊ 50% လည်ပတ်မှု၊ Vibra-Cell VC130 တွင် ပမာဏ 80%၊ Sonics၊ Newton၊ USA) fibril နမူနာများ သေးငယ်သော fibrils ၏အတော်လေးတူညီသောအရွယ်အစားဖြန့်ဝေနှင့်အတူ။
FCS/FCCS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းနှင့် အရောင်နှစ်ရောင်တိုက်ဆိုင်မှုရှာဖွေခြင်း (TCCD) ကို PIE မုဒ်ကို အသုံးပြု၍ FLIM-FRET မိုက်ခရိုစကုပ်စမ်းသပ်မှုများအတွက် အသုံးပြုသည့် MT200 အချိန်ဖြင့်ဖြေရှင်းထားသော ချောင်းဆုံအမိုက်ခရိုစကုပ် (Pico-Quant၊ ဘာလင်၊ ဂျာမနီ) တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဤစမ်းသပ်မှုများအတွက် လေဆာပါဝါအား 6.0 µW (481 nm) နှင့် 6.2 µW (637 nm) သို့ ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်။ဤလေဆာပါဝါများ၏ပေါင်းစပ်မှုကို အကောင်းဆုံးရေတွက်မှုနှုန်းများရရှိစေရန်နှင့် photobleaching နှင့် saturation ကိုရှောင်ရှားရာတွင် အသုံးပြုသည့် fluorophores အတွဲများအတွက် ဆင်တူတောက်ပမှုထုတ်လုပ်ရန် ရွေးချယ်ထားပါသည်။ဒေတာစုဆောင်းခြင်းနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှစ်ခုစလုံးသည် စီးပွားဖြစ်ရရှိနိုင်သော SymphoTime64 ဗားရှင်း 2.3 ဆော့ဖ်ဝဲ (PicoQuant၊ ဘာလင်၊ ဂျာမနီ) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
LLPS ကို အသုံးပြု၍ ရရှိသော သီးခြား αS/Tau စုစည်းမှု နမူနာများကို သင့်လျော်သော monomolecular အာရုံစူးစိုက်မှုအဖြစ် အထီးကျန်ကြားခံတွင် ရောနှောထားသည် (ပုံမှန်အားဖြင့် 1:500 သည် အညစ်အကြေးများကို coacervate နမူနာများမှ ခွဲထုတ်သည့်အခါ ပြင်းအားနည်းပါးနေပြီဖြစ်သောကြောင့်)။နမူနာများကို 1 mg/mL ၏ပြင်းအား 1 mg/mL တွင် BSA ဖြေရှင်းချက်ဖြင့်ကြိုတင်အဖုံးဖုံးများ (Corning၊ USA) သို့ တိုက်ရိုက်အသုံးပြုခဲ့သည်။
အစိမ်းရောင်နှင့် အနီရောင်ချန်နယ်များရှိ PIE-smFRET ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ monomeric ဖြစ်ရပ်များကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ပြင်းထန်မှုနည်းသောအချက်ပြမှုများကို စစ်ထုတ်ရန် ဖိုတွန် 25 ၏ ပြင်းထန်မှုအဆင့်ကို လျှော့ချအသုံးပြုခဲ့သည် (အထီးကျန်သော အစုလိုက်နမူနာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက monomers အရေအတွက်ထက် ပိုများသည်ကို သတိပြုပါ)။ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အစုလိုက်ရွေးချယ်ရန်အတွက် သန့်စင်သောမိုနိုမာနမူနာများ၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှရရှိသော monomeric αS ၏ပျမ်းမျှပြင်းထန်မှုငါးဆအဖြစ် တွက်ချက်ထားပါသည်။TSCPC ဒေတာရယူမှုနှင့်အတူ PIE drive circuit သည် နောက်ခံနှင့် spectral crosstalk ကိုဖယ်ရှားပစ်ရန် ကူညီပေးသည့် တစ်သက်တာအလေးချိန်စစ်ထုတ်မှုအပလီကေးရှင်းကို ဖွင့်ထားသည်။အထက်အဆင့်သတ်မှတ်ချက်များကို အသုံးပြု၍ ရွေးချယ်ထားသော မီးတောက်ပြင်းထန်မှုအား ကြားခံ-သီးသန့်နမူနာများ၏ ဖြစ်ပျက်မှုဆိုင်ရာ ဟစ်စတိုဂရမ်များနှင့် ပြင်းထန်မှု/ပုံးများမှ ဆုံးဖြတ်ထားသော ပျမ်းမျှနောက်ခံအချက်ပြမှုကို အသုံးပြု၍ ပြုပြင်ထားပါသည်။ကြီးမားသောအစုအဝေးများနှင့် ဆက်စပ်နေသော ကွဲထွက်မှုများသည် ပုံမှန်အားဖြင့် အချိန်ခြေရာခံအတွင်း ဆက်တိုက် bins များစွာကို သိမ်းပိုက်သည် (1 ms မှ သတ်မှတ်ထားသည်)။ဤအခြေအနေမျိုးတွင်၊ အမြင့်ဆုံး ခွန်အားကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။FRET နှင့် stoichiometric ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ သီအိုရီအရ ဆုံးဖြတ်ထားသော gamma factor γ (0.517) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။Spectral crosstalk နှင့် တိုက်ရိုက် excitation ပံ့ပိုးမှုများသည် အသုံးပြုထားသော excitation လေဆာပါဝါတွင် (စမ်းသပ်သတ်မှတ်ထားသည်) မှာ အားနည်းပါသည်။ပေါက်ကွဲမှုတစ်ခုတွင် FRET ၏ထိရောက်မှုနှင့် stoichiometry ကိုအောက်ပါအတိုင်းတွက်ချက်သည်။