310 10*1mm Stainless steel coiled tubing ဓာတုအစိတ်အပိုင်း၊ spidroin ၏ N-terminal domains များသည် amyloid fibrils ကိုအခြေခံ၍ hydrogels ပုံစံဖြစ်ပြီး ပရိုတင်းကို ထိန်းညှိပေးသည့် platform တစ်ခုဖြစ်သည်။

Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။
ဆလိုက်တစ်ခုလျှင် ဆောင်းပါးသုံးပုဒ်ကို ပြသသည့် ဆလိုက်ဒါများ။ဆလိုက်များတစ်လျှောက် ရွှေ့ရန် နောက်ဘက်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် ဆလိုက်တစ်ခုစီကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ထိန်းချုပ်မှုခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။

သတ်မှတ်ချက်

310 10*1mm Stainless steel coiled tubing ပေးသွင်းသူများ

ဓာတုဖွဲ့စည်းမှု

စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများ

ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော ပင့်ကူပိုးပရိုတင်းများ (ပင့်ကူပိုးပရိုတင်း) များသည် ဇီဝပစ္စည်းအသစ်များ တီထွင်ထုတ်လုပ်ရာတွင် အလားအလာများစွာရှိသော်လည်း ၎င်းတို့၏ ဘက်စုံသုံးနှင့် ပေါင်းစည်းလေ့ရှိသော သဘာဝက ၎င်းတို့ကို ရရှိရန်ခက်ခဲပြီး အသုံးပြုရလွယ်ကူစေသည်။ဤတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော အသေးစား စပီဒရိုရင်း ပရိုတင်းများနှင့် အရေးကြီးသည်မှာ၊ N-terminal domain (NT) ကိုယ်တိုင်က အပူချိန် ၃၇ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် လျင်မြန်စွာ မိမိကိုယ်ကို ပံ့ပိုးပေးနိုင်ပြီး ဖောက်ထွင်းမြင်ရသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များအဖြစ် ဖြစ်ပေါ်လာပါသည်။NT နှင့် အစိမ်းရောင် ချောင်းပရိုတင်း သို့မဟုတ် purine nucleoside phosphorylase ပါဝင်သော ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများသည် အပြည့်အဝလုပ်ဆောင်နိုင်သော ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းများဖြစ်သည်။ဟိုက်ဒရိုဂျယ်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော NT နှင့် ပေါင်းစည်းထားသော ပရိုတင်းများသည် မြင့်မားသောအထွက်နှုန်းကို ပေးစွမ်းပြီး ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များကို ပွင့်လင်းမြင်သာမှု၊ ချိတ်ဆက်မှုမရှိဘဲ gelation နှင့် မြင့်မားသောသိပ်သည်းဆတွင် တက်ကြွသောပရိုတိန်းများကို တိုက်ရိုက်မလှုပ်ရှားစေခြင်းကဲ့သို့သော ဆွဲဆောင်မှုရှိသောဂုဏ်သတ္တိများနှင့်အတူ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များကို ပံ့ပိုးပေးကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက ဖော်ပြသည်။
ပင့်ကူများတွင် မတူညီသောပိုးဂလင်းခုနစ်ခုအထိရှိပြီး တစ်ခုစီသည် ပိုးအမျိုးအစားတစ်ခုစီကိုထုတ်လုပ်သည်။ပိုးမျိုးစိတ် ခုနစ်မျိုးစလုံးသည် ပင့်ကူပိုးပရိုတင်း (spidroins) အကြွင်းအကျန် 6000 ခန့် ရှည်လျားပြီး လုံးပတ် N- နှင့် C-terminal domains (NT နှင့် CT) 1,2 တို့ဖြင့် ဝန်းရံထားသော အလယ်ဗဟိုတွင် ကြီးမားသော အထပ်ထပ်ဒေသတစ်ခု ပါရှိသည်။အကျယ်ပြန့်ဆုံး လေ့လာတွေ့ရှိရသော ပိုးအမျိုးအစားဖြစ်သည့် ပင်မအမ်ပူလာကို မူလ အမ်ပူလာဂလင်းက ထုတ်လုပ်သည်။ဤဂလင်းတွင်၊ epithelial cells ၏ monolayer သည် spidroin ပရိုတင်းများကို ပေါင်းစပ်ပြီး ၎င်းတို့အား အလွန်မြင့်မားသောပြင်းအား (30-50% w/v) 3,4 တွင် ပျော်ဝင်နိုင်သောပုံစံ (doping) ဖြင့် ရှိနေသည့် gland ၏ lumen အတွင်းသို့ လျှို့ဝှက်ထုတ်ပေးသည်။ဂလင်းရှိ ပင်မ ampullar spidroin ပရိုတင်းများ၏ အဖွဲ့အစည်းနှင့် ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းမှုကို အချေအတင် ဆွေးနွေးခဲ့ပြီးဖြစ်သော်လည်း စမ်းသပ်မှု အထောက်အထား အများစုသည် ယေဘူယျအားဖြင့် helical နှင့်/သို့မဟုတ် ကျပန်း helical ပုံစံနှင့် micellar သို့မဟုတ် lamellar structures5,6,7,8,9,10 ရှိနေခြင်းကို ညွှန်ပြပါသည်။ထပ်တလဲလဲ domains များသည် ပိုးမျှင်များ၏ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများကို ထိန်းညှိပေးကာ β-sheet nanocrystals နှင့် amorphous structures 11,12,13,14,15, end domains များသည် ပိုးဂလင်းတစ်လျှောက် ပြောင်းလဲနေသော အခြေအနေများကို တုံ့ပြန်ရန်အတွက် ပိုးမျှင်များကို ထိန်းညှိပေးပါသည်။ပိုးမွှားဖွဲ့စည်းခြင်းကို ထိန်းချုပ်ခြင်းဖြင့် 19. Terminal domains များကို ဆင့်ကဲထိန်းသိမ်းထားပြီး ၎င်းတို့၏လုပ်ဆောင်ချက်သည် spidroin ပရိုတင်း 2,20,21 အားလုံးတွင် တူညီနိုင်ပါသည်။ဂလင်းကို ဖြတ်သန်းစဉ်တွင်၊ Spidroin ၏ pH သည် 7.6 မှ < 5.716 ခန့်အထိ လျော့ကျသွားပြီး တဖြည်းဖြည်း ကျဉ်းသွားသော ပြွန်မှတဆင့် ရွေ့လျားမှုဖြင့် ဖြည်လိုက်ကာ ဆန့်ထွက်ခြင်းဖြင့် တိုးလာပါသည်။ဖြေရှင်းချက်တွင်၊ CT သည် α-helical constitutive parallel dimer17 ဖြစ်သည်၊ သို့သော် pH နည်းပါးခြင်းနှင့် shear force ကိုတုံ့ပြန်သောအခါ CT သည် β-layers16, 17 ကိုဖွင့်ကာ ပြောင်းကာ Convert 16 ၏ ထပ်တလဲလဲနေရာများတွင် β-အလွှာများကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ NT သည် monomeric အောက်တွင်ရှိသည်။ ဂလင်း၏ lumen အတွင်းရှိအခြေအနေများကိုထင်ဟပ်စေပြီး spidroin ၏ပျော်ဝင်မှုကိုပြေလည်အောင်ဆောင်ရွက်ပေးသော်လည်း pH လျှော့ချခြင်းဖြင့် carboxylic acid side chains အများအပြား၏ protonation သည် pKa 6.5 နီးပါးရှိသော NT ၏ dimerization ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်၊ ထို့ကြောင့် NT ကိုတည်ငြိမ်စေပြီး spidroin ကိုအကြီးစားပြုပြင်ပေးသည်။ ပမာဏ။ကွန်ရက် ၁၆၊၁၈။ထို့ကြောင့်၊ NT သည် ဖိုက်ဘာ ၂၃၊၂၄၊၂၅ တွင် အလွှာရှိ မိုနိုမာတစ်ခုမှ ဖိုက်ဘာ ၂၃၊၂၄၊၂၅ သို့ ပြောင်းလဲရာတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပါသည်။NT သည် 16၊ 18၊ 19၊ 20၊ 26၊ 27၊ 28၊ 29 အထိ လေ့လာခဲ့သော အခြေအနေအားလုံးအောက်တွင် အလွန်ပျော်ဝင်ပြီး helical ကျန်ရှိနေသည်၊ ၎င်းသည် မျိုးကွဲပရိုတိန်းထုတ်လုပ်မှုအတွက် ပျော်ဝင်မှုတိုးစေသည့် အညွှန်းတစ်ခုအဖြစ် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။
NT တစ်ခု၊ တိုတောင်းသော ထပ်ခါထပ်ခါနေရာတစ်ခု၊ CT တစ်ခု၊ နှင့် His6 tag (His-NT2RepCT) ပါ၀င်သော ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော ပင့်ကူပိုးပရိုတင်းသည် ဇာတိပင့်ကူပိုးပရိုတိန်းကဲ့သို့ ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်ပြီး ပိုးပင့်ကူများ၏ မူရင်းအရေးပါသောလက္ခဏာများကို အတုယူပါသည်။ .လွှမ်းခြုံ 25.31 ။၎င်း၏-NT2RepCT သည် pH 525,32,33,34,35 ရေချိုးခန်းထဲသို့ pH 8 ပျော်ဝင်နိုင်သောအလွှာကို ထုတ်လွှတ်သည့် biomimetic စက်ကို အသုံးပြု၍ စဉ်ဆက်မပြတ်အမျှင်များအဖြစ်သို့ လည်ပတ်နိုင်သည်။His-NT2RepCT ကိုဖော်ပြသည့် အီးကိုလီ၏ ဇီဝဓာတ်ပေါင်းဖိုသည် အချဉ်ဖောက်ခြင်းနှင့် ကုသပြီးနောက် သန့်စင်ပြီးနောက် အထွက်နှုန်း> 14 g/L ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။မြင့်မားသောအထွက်နှုန်း၊ မြင့်မားသောပျော်ဝင်နိုင်စွမ်းနှင့် အက်စစ်ဓာတ်အခြေအနေများအတွက် His-NT2RepCT ၏လုံလောက်သောတုံ့ပြန်မှုသည် NT23၊ 25၊ 34 တို့နှင့်သက်ဆိုင်သည်။
ဤတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် 37°C တွင် ပရိုတင်းဖြေရှင်းချက်တစ်ခုကို ပျိုးထောင်ခြင်းဖြင့် NT တစ်ခုတည်းအပါအဝင် ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော စpiဒရုန်းပရိုတင်းများမှ ပွင့်လင်းမြင်သာသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ ဖွဲ့စည်းမှုကို အစီရင်ခံပါသည်။thioflavin T fluorescence (ThT)၊ Fourier အသွင်ပြောင်း အနီအောက်ရောင်ခြည် spectroscopy (FTIR)၊ nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) နှင့် transmission electron microscopy (TEM) ကို အသုံးပြု၍ NT နှင့် microspider ပရိုတိန်းများသည် β-sheets နှင့် amyloid-like fibrils အဖြစ်သို့ structural transformation ပြုလုပ်နေသည်ကို တွေ့ရှိရပါသည်။ gels ဖွဲ့စည်းသောအခါ။ထို့အပြင်၊ NT နှင့် အစိမ်းရောင်ချောင်းပရိုတင်း (GFP) သို့မဟုတ် purine nucleoside phosphorylase (PNP) ၏ ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများသည် အပြည့်အဝလုပ်ဆောင်နိုင်သော ပေါင်းစပ်မှုအပိုင်းအစများဖြင့် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များကို ဖန်တီးသည်။ဇီဝကမ္မအခြေအနေများအောက်တွင် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်များ လျင်မြန်စွာဖွဲ့စည်းမှုနှင့်အတူ၊ မျိုးရိုးလိုက်သောအိမ်ရှင်များတွင် မြင့်မားသောထုတ်လွှတ်မှုအသုံးအနှုန်းသည် အင်ဂျင်နီယာဆိုင်ရာလုပ်ငန်းဆောင်တာများဖြင့် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်များ ကုန်ကျစရိတ်သက်သာစွာထုတ်လုပ်နိုင်ခြေကို ဖွင့်ပေးသည်။
အစီရင်ခံထားသည့် recombinant spidroin ပရိုတင်း 36 နှင့်မတူဘဲ၊ His-NT2RepCT သည် pH 8 တွင် Tris-HCl ကြားခံတွင်တည်ငြိမ်ပြီး မိုးရွာသွန်းခြင်းမရှိဘဲ 500 mg/mL အထိ စုစည်းနိုင်သည်။ထို့ကြောင့်၊ ဤပရိုတိန်းသည် အပူချိန် 37°C တွင် ပေါက်ဖွားသောအခါတွင် ဤပရိုတင်းသည် ကြည်လင်ပြတ်သားပြီး မိမိကိုယ်ကို ပံ့ပိုးပေးသည့် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ လျင်မြန်စွာ ဖွဲ့စည်းသည်ကို တွေ့ရှိရခြင်းအတွက် ကျွန်ုပ်တို့ အံ့သြမိပါသည်။နောက်ထပ်လေ့လာမှုများက His-NT2RepCT gelation သည် ပရိုတင်းပါဝင်မှု ကျယ်ပြန့်သောအကွာအဝေး (10–300 mg/mL) တွင် ဖြစ်ပေါ်ခဲ့ပြီး ဤအာရုံစူးစိုက်မှုသည် gelation အချိန်နှင့် ပြောင်းပြန်ဆက်စပ်နေကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 1c နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 1)။His-NT2RepCT မှ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်ဖွဲ့စည်းခြင်းကို ပြေလည်အောင်ဆောင်ရွက်ပေးသည့် အစိတ်အပိုင်းများကို သိရှိရန်၊ ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဒိုမိန်းတစ်ခုစီကို တစ်ဦးချင်းနှင့် အမျိုးမျိုးသောပေါင်းစပ်မှုများတွင် ဓာတ်ဘူးပြောင်းပြန်လှန်စမ်းသပ်မှု (ပုံ 1a၊b) ကို အသုံးပြု၍ စစ်ဆေးခဲ့သည်။ရွာသွန်းသော 2Rep (ပုံ. 1b) မှလွဲ၍ 1 နာရီထက်နည်းသော ပရိုတင်းပါဝင်မှု 300 mg/mL တွင် စမ်းသပ်ထားသော အပိုင်းအစများအားလုံးကို ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော spidroin ၏ gels များ။၎င်းသည် NT နှင့် CT တစ်ခုတည်း၊ ပေါင်းစပ် သို့မဟုတ် ထပ်ခါတလဲလဲနှင့် ဆက်စပ်နေပါက 37°C တွင် gel လုပ်နိုင်ပြီး His6 tag သည် ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို သိသာထင်ရှားသောအတိုင်းအတာအထိ မထိခိုက်စေကြောင်း အကြံပြုထားသည်။NT သည် အလွန်ပျော်ဝင်ပြီး တည်ငြိမ်သောပရိုတင်းတစ်မျိုးဖြစ်သည်ဟူသော ဘုံအယူအဆအရ၊ ယခင်အစီရင်ခံစာများတွင် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော spidroin hydrogels များသည် ထပ်ခါတလဲလဲနေရာများနှင့်/သို့မဟုတ် CTs များတွင် တူညီသောပြောင်းလဲမှုများအတွက် gelation သက်ရောက်မှုရှိသည်ဟု NT ကိုယ်တိုင်ယူဆနိုင်သည်။gelation ကိုရှာဖွေတွေ့ရှိမှုမျှော်လင့်မထားပါ။နောက်ဆက်တွဲဇယား 1) 37၊ 38၊ 39။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ ≥ 300 mg/mL ပြင်းအား ≥ 300 mg/mL (ပုံ. 1c) တွင် 10 မိနစ်အတွင်း NT သည် ဂျယ်လီထွက်နေပြီဖြစ်သည်။NT ၏ ပြင်းအားအမျိုးမျိုးဖြင့် ပြောင်းပြန်လှန်စမ်းသပ်မှုများတွင် NT solution သည် His-NT2RepCT ထက် 50 mg/mL ထက် ပိုမြန်ကြောင်းပြသခဲ့သည် (w/v၊ ပုံ 1c)။
ဤလုပ်ငန်းတွင် လေ့လာခဲ့သော အမျိုးမျိုးသော spidroin တည်ဆောက်ပုံများ၏ သရုပ်ဖော်ပုံ။b ပုလင်းကို ပြောင်းပြန်လှန်ခြင်းဖြင့် အမျိုးမျိုးသော recombinant spidroin ပရိုတင်းများ (300 mg/mL) အတွက် Gel အချိန် 37°C တွင်။(<300 mg/mL)၊ 2Rep precipitates (300 mg/mL၊ 5 mm scale) မပေါက်ဘဲ CT gel ကို ချက်ချင်းထိုးပါ။c 37°C တွင် ဖော်ပြထားသော ပရိုတိန်းပါဝင်မှုများသော His-NT2RepCT နှင့် NT ၏ ဂျယ်လ်အချိန်။ဃ ပင့်ကူပါရှိသော His-NT2RepCT နှင့် NT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ ဓာတ်ပုံများနှင့် အောက်တွင် အသီးသီး ရိုက်နှိပ်ထားသော စာလုံး (200 mg/mL၊ စကေးဘား 5 မီလီမီတာ)။
အမျိုးမျိုးသော recombinant spidroin ပရိုတိန်းများဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များသည် အရောင်အနည်းငယ်ကွဲပြားပြီး သာမန်မျက်စိဖြင့် စူးစမ်းလေ့လာမှုသည် ကွဲပြားသော ပွင့်လင်းမြင်သာမှုဒီဂရီများကို ပြသသည် (ပုံ။ 1b)။NT gels များသည် အခြား gels များ အရောင်မှိုင်းနေချိန်တွင် ထူးခြားစွာ ရှင်းလင်းပါသည်။သူ၏-NT2RepCT နှင့် NT gels များကို ဆလင်ဒါပြွန်ထဲသို့ ထည့်လိုက်သော ပုံစံခွက်မှ နဂိုအတိုင်း ဖယ်ရှားနိုင်သည် (ပုံ။ 1d)။
သဘာဝ ပင့်ကူပိုးအဖုံးများ ဂျယ်ကို ယခုတွေ့ရှိထားသည့် အခြေအနေများအောက်တွင် ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော စပီဒရိုရင်း ပရိုတင်းများ gelation ဖြစ်စေခြင်း ရှိ၊မရှိ စမ်းသပ်ရန်အတွက် ဆွီဒင်တံတား ပင့်ကူကြီး (Larinioides sclopetarius) ၏ ကြီးမားသော ampulla gland မှ အပေါ်ယံလွှာများကို စုဆောင်းခဲ့သည်။အပေါ်ယံအလွှာများကို 20 mM Tris-HCl ကြားခံတွင် 50 mg/mL (တိုင်းတာထားသော ခြောက်သွေ့သောအလေးချိန်ပေါ်အခြေခံ၍) တွင် သိမ်းဆည်းထားသော်လည်း 21 ရက်ကြာပေါက်ဖွားချိန်တွင် 37°C (နောက်ဆက်တွဲပုံ 2a) တွင် gelation မတွေ့ရပါ။
အဆိုပါ gels များကို အရေအတွက်တိုင်းတာရန်အတွက် rheological တိုင်းတာမှုများကို gelation ဖြစ်စဉ်ကိုလေ့လာရန်နှင့် အလုံးစုံစက်ပိုင်းဆိုင်ရာဂုဏ်သတ္တိများကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည်။အထူးသဖြင့်၊ မြင့်မားသောအပူချိန်တွင်သိုလှောင်မှုပုံစံ (ပျော့ပြောင်းမှု) ကိုစောင့်ကြည့်ခြင်းသည် gelling အပူချိန်နှင့် coating ၏ viscoelastic ဂုဏ်သတ္တိများနှင့်ပတ်သက်သောအချက်အလက်များကိုပေးနိုင်သည်။အပူချိန်မြင့်တက်လာသောစမ်းသပ်မှုများ (25-45°C တွင် 1°C/min၊ ယခင်လေ့လာမှုများအတိုင်း သဘာဝပိုးထည်စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်များကိုအသုံးပြုထားသည်) 40,41 တွင် His-NT2RepCT နှင့် NT ဖြေရှင်းချက်များ၏ သိုလှောင်မှု module သည် အပူချိန်တိုးလာသည်နှင့်အမျှ တိုးလာကြောင်းပြသခဲ့သည်။တိုးလာသည် (ပုံ။ 2 နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 3)။မှတ်သားဖွယ်မှာ၊ NT module သည် His-NT2RepCT နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် နိမ့်သောအပူချိန်တွင် စတင်ကြီးထွားလာပြီး NT သည် His-NT2RepCT နှင့် 37°C တွင် တိုက်ရိုက်ပေါက်ဖွားလာသောအခါ တွေ့ရှိသည့် ပိုမြန်သော gel အချိန်နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။နောက်ဆက်တွဲ အပူချိန်ကျဆင်းပြီးနောက်၊ သိုလှောင်မှုပုံစံသည် နိမ့်သောတန်ဖိုးများသို့ ပြန်မလာဘဲ ဆုံးရှုံးမှုပုံစံ (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 3 ကိုကြည့်ပါ)၊ အပူဖြင့် ပြန်မလှည့်နိုင်သော တည်ငြိမ်သော gelation ကိုညွှန်ပြသော ဆုံးရှုံးမှုတန်ဖိုးများ (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 3 ကိုကြည့်ပါ)။gelation ပြီးနောက်၊ နောက်ဆုံး elastic modulus သည် His-NT2RepCT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များအတွက် 15 မှ 330 kPa မှ 100–500 mg/mL တွင်ရှိပြီး NT hydrogels အတွက် နောက်ဆုံး elastic modulus (100–500 mg/mL) သည် 2 မှ 1400 အထိရှိသည်။ kPa (ပုံ။ ၊ 2 နှင့် ချဉ်းကပ်လမ်းဒေတာအပြည့်အစုံ) နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 3 ကိုကြည့်ပါ)။
His-NT2RepCT (300 mg/mL) နှင့် b NT (300 mg/mL) တို့ကို တုန်ခါခြင်းဖြင့် တိုင်းတာနေစဉ် အပူချိန်ပြောင်းလဲမှု။မြှားများသည် အပူချိန်လမ်းကြောင်းကို ညွှန်ပြပြီး သိုလှောင်မှု module ဒေတာ၏ ပေါ့ပါးသောအရိပ်သည် ဆူညံသံတိုးလာရခြင်း၏အကြောင်းရင်းဖြစ်သည့် ထုတ်လုပ်သူမှသတ်မှတ်ထားသည့်ကိရိယာအတွက် torque တန်ဖိုးများထက် နိမ့်သောစမ်းသပ်မှုကို သရုပ်ဖော်သည်။c မြင့်မားသောအပူချိန် (100၊ 300၊ နှင့် 500 မီလီဂရမ်/မီလီဂရမ်) ပြီးနောက် His-NT2RepCT နှင့် NT ၏အဆုံး-မော်ဂျူးစုစည်းမှု။မော်ဂျူးဖတ်ခြင်းအားလုံးကို ကြိမ်နှုန်း 0.1 Hz ဖြင့် ရယူသည်။
gelation နှင့်ဆက်စပ်သောပုံစံပြောင်းလဲမှုများကိုစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်အလားအလာရှိသောနည်းလမ်းတစ်ခုအနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 37°C တွင် gelation မတိုင်မီနှင့်အပြီးတွင် His-NT2RepCT နှင့် NT ၏ FTIR spectra ကို မှတ်တမ်းတင်ထားပါသည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ His-NT2RepCT နှင့် NT ဖြေရှင်းချက်များ၏ Spectra သည် 1645 cm-1 တွင် အသံထွက်သည့်တီးဝိုင်းဖြင့် α-helix/random coil အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံကိုပြသသည့် ပရိုတင်းများနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ဟိုက်ဒရိုဂျယ်နှစ်မျိုးလုံးအတွက်၊ gelation သည် 1617 စင်တီမီတာ-1 နှင့် 1695 စင်တီမီတာ-1 (ပုံ 3a၊ b) ခန့်တွင် အလယ် I band တွင် လက်နှစ်ဖက်ကို gelation ဖြစ်ပေါ်စေသည် (ပုံ 3a၊ b) သည် antiparallel β-စာရွက်ဖွဲ့စည်းပုံများဖွဲ့စည်းခြင်းကိုဖော်ပြသည်။ဤပြောင်းလဲမှုများကို သက်ဆိုင်ရာ ဒုတိယ ဆင်းသက်လာမှုနှင့် ခြားနားချက် gelation spectra (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 4b) တွင်လည်း ရှင်းလင်းစွာ မြင်တွေ့နိုင်ပါသည်။NT β-layer ၏ bands နှစ်ခုသည် His-NT2RepCT ထက်ပိုမိုထင်ရှားပြီး NT hydrogel ရှိ β-layer bands များ၏ စုစုပေါင်းပါဝင်မှုသည် NT2RepCT hydrogel ထက်ပိုမိုမြင့်မားကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။
37°C တွင် His-NT2RepCT နှင့် b NT (500 mg/mL) ၏ FTIR စုပ်ယူမှု spectra (ဖြေရှင်းချက်) မတိုင်မီနှင့် (gel) ပေါက်ဖွားပြီးနောက်။c ရပ်ဆိုင်းထားသော 50 mg/ml NT2RepCT gels နှင့် d NT တို့၏ TEM ပုံများ။စကေးဘား 200 nm ။e His-NT2RepCT နှင့် NT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ ဖိုက်ဘာအချင်းများ။n = တိုင်းတာထားသော fibrils 100၊ p < 0.0001။အမှားဘားများသည် စံသွေဖည်မှုကို ပြသသည်။error bars ၏ အလယ်ဗဟိုသည် ဆိုလိုသည်။ကိန်းဂဏန်းပိုင်းခြားစိတ်ဖြာချက်အတွက် တွဲမထားသည့် t-test (အမြီးနှစ်ကြောင်း) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။f တုန်လှုပ်ခြင်းမရှိဘဲ 37°C တွင် အမျိုးမျိုးသော စပီဒရိုရင်း ပရိုတင်းများ (100 mg/mL) ၏ ThT ဖြာထွက်ခြင်း။g NT (100 mg/mL) inoculation tests 100 mg/mL NT NT gel မှ 0%, 5%, 10%, နှင့် 20% အစေ့များ။
transmission electron microscopy (TEM) ကို အသုံးပြု၍ ဂျယ်ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်တွင် အမိုင်အလွိုက်ကဲ့သို့ အမျှင်ဓာတ်များ ပါဝင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ။ 3c၊ 3d)။NT-ဖွဲ့စည်းထားသော fibrils များသည် ရှည်လျားသည် (5-12 nm) အချင်းရှိပြီး အကိုင်းအခက်မရှိ၊ His-NT2RepCT မျှင်များသည် အရှည်ပိုတိုပြီး အချင်း (7-16 nm) (ပုံ 3e) တွင် ရှည်လျားသည်။ဤရလဒ်များသည် thioflavin T (ThT) assay ကို အသုံးပြု၍ fibrosis ၏ kinetics ကိုလိုက်နာနိုင်စေပါသည်။ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော စပီဒရိုရင်း ပရိုတင်းများအားလုံးအတွက်၊ နမူနာများကို 37°C တွင် ပေါက်ဖွားသောအခါ ချောင်းအချက်ပြမှု တိုးလာသည် (ပုံ။ 3f၊ နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 5a)။ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနှင့်အညီ၊ NT နှင့် His-NT2RepCT ၏ အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းစစ်ဆေးခြင်းတွင် ThT-positive အစုလိုက်များ သိသိသာသာ ဒေသအတွင်း စုစည်းမှုမရှိဘဲ ThT fluorescence သည် တစ်သမတ်တည်း တိုးလာကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။ThT-positive fibrils များဖွဲ့စည်းခြင်းသည် NT နှင့် His-NTCT turbidity (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 5d) နှင့် မတွဲဘဲ၊ ဆိုလိုသည်မှာ gel ရှိ fibrils ကွန်ရက်တစ်ခုသည် gel ၏ကြည်လင်ပြတ်သားမှုကိုအလျှော့မပေးဘဲ ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည်။ကြိုတင်ဖွဲ့စည်းထားသော fibrils အနည်းငယ်ကိုထည့်ခြင်းဖြင့် မျိုးစေ့ထုတ်ခြင်းဖြင့် အချို့သော amyloids42,43,44 ၏ fibril များဖြစ်ပေါ်ခြင်းကို သိသာထင်ရှားစွာ အရှိန်မြှင့်နိုင်သော်လည်း NT hydrocoagulants ၏အဖြေတစ်ခုတွင် 5%, 10% သို့မဟုတ် 20% (w/w) NT ကို ပေါင်းထည့်သည်။မျိုးစေ့အကျိုးသက်ရောက်မှု (ပုံ။ 3g)။ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်ရှိ fibrils သည် အတော်အတန် ပြုပြင်ပြီး အစေ့အဖြစ် အသုံးမပြုနိုင်ခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။
မြင့်မားသော အပူချိန်တွင် ပေါင်းစပ်ထားသော စပီဒရိုရင်း ပရိုတင်းများ၏ မမျှော်လင့်ထားသော အပြုအမူသည် ဂျယ်ဖွဲ့စည်းမှုနှင့် ဆက်စပ်သော ပုံစံပြောင်းလဲမှုများကို ဖော်ထုတ်ရန် နောက်ထပ် နျူကလီးယား သံလိုက်ပဲ့တင်ရိုက်ခတ်မှု (NMR) spectroscopy လေ့လာမှုများကို လှုံ့ဆော်ခဲ့သည်။37°C တွင် အချိန်နှင့်အမျှ မှတ်တမ်းတင်ထားသော His-NT2RepCT ဖြေရှင်းချက်များ၏ NMR ရောင်စဉ်တန်းသည် CT သည် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ခေါက်ထားဆဲဖြစ်ကြောင်း ပြသနေသော်လည်း NT နှင့် 2Rep အချက်ပြမှုများ ပျောက်ကွယ်သွားသည် (ပုံ. 4a)၊ ၎င်းမှာ အဓိကအားဖြင့် NT နှင့် 2Rep ဖြစ်သည်ဟု အကြံပြုခြင်းမှာ ၎င်းသည် ၎င်း၏ဖွဲ့စည်းပုံကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းထိန်းချုပ်ထားသည့် NT နှင့် 2Rep ဖြစ်သည်၊ NT2RepCT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်။CT အချက်ပြမှုကို ၎င်း၏ မူလပြင်းထန်မှု၏ 20% တွင် လျော့ချထားပြီး CT ကိုလည်း အများအားဖြင့် ပုံသေထားပြီး ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ဖွဲ့စည်းပုံတွင် ထည့်သွင်းထားကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ကြိုတင်မွေးမြူထားသောနမူနာတွင်ကဲ့သို့ မိုဘိုင်းလ်ကဲ့သို့ဖြစ်သည့် CT ၏သေးငယ်သောအပိုင်းအတွက်၊ အဖြေ NMR မှလေ့လာတွေ့ရှိရသော spectra သည် His-NT2Rep ၏ ပူးတွဲပါအပိုင်းကို ခက်ခဲစွာ ရွှေ့ပြောင်းနိုင်ခြင်းကြောင့်ဖြစ်နိုင်သည်ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်များ-NT2RepCT ၏ -state of NMR ရောင်စဉ်သည် α-helices နှင့် β-layers များ၏ ထင်ရှားသောတည်ရှိမှုကို ထုတ်ဖော်ပြသပြီး အနည်းငယ်သောအတိုင်းအတာအထိ၊ ကျပန်းကွိုင်ပုံစံ (ပုံ။ 4b)။NT တွင်သာရှိသော methionine အကြွင်းအကျန်များ၏ ဓာတုပြောင်းလဲမှုဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ဤဒိုမိန်းသည် β-စာရွက်ဖွဲ့စည်းပုံသို့ ပြောင်းလဲသွားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ဖြေရှင်းချက်ရှိ NT ၏ အချိန်-မူတည်သည့် ရောင်စဉ်တန်းသည် အချက်ပြပြင်းထန်မှု (ပုံ 4c) တွင် တစ်ပုံစံတည်း ကျဆင်းသွားသည်ကို ပြသခဲ့ပြီး NT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ အစိုင်အခဲအခြေအနေ NMR သည် NT အကြွင်းအကျန်အများစုကို β-စာရွက်ဖွဲ့စည်းပုံများအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲသွားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 4d)။2Rep ၏ ပေါင်းစပ်မှုကို စုစည်းရန် သဘောထားကြောင့် သီးခြားမဆုံးဖြတ်နိုင်ပါ။သို့သော်၊ NTCT နှင့် His-NT2RepCT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ အစိုင်အခဲအခြေအနေ NMR ရောင်စဉ်သည် အလွန်ဆင်တူပုံရသည် (ပုံ။ 4b; နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 6b)၊ 2Rep သည် His-NT2RepCT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာအပိုင်းတွင် အနည်းငယ်သာပါဝင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။CT hydrogels များအတွက်၊ α-helices၊ β-sheets နှင့် ကျပန်း helical အလယ်တန်းတည်ဆောက်ပုံများ တည်ရှိနေကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 6d)။CT ၏ အချို့သော အစိတ်အပိုင်းများသည် α-helices များအဖြစ် ကျန်ရှိနေသော်လည်း အချို့မှာ β-စာရွက်များ ဖြစ်နေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ထို့ကြောင့် NMR spectroscopy ၏ ရလဒ်များအရ NT သည် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ဖွဲ့စည်းမှုအတွက် အရေးကြီးပြီး 2Rep နှင့် CT နှင့် ပေါင်းစပ်လိုက်သော β-စာရွက်ပုံစံအဖြစ် ပြောင်းလဲသွားကြောင်း အကြံပြုပါသည်။၎င်းနှင့်ကိုက်ညီပါက၊ amyloid spatial zippers များသည် NT domain ၏ helices ငါးခုလုံးတွင်ဖြစ်နိုင်ချေရှိသည်ကို မကြာသေးမီက တွေ့ရှိခဲ့ပြီး Waltz algorithm မှ helix 1 တွင် amyloidogenic ဒေသကို ခန့်မှန်းခဲ့သည် (ပုံ 4e)။
37°C တွင် 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT ဖြေရှင်းချက် (အပြာရောင်) ၏ 2D ရောင်စဉ်ကို (အပြာရောင်) နှင့် 37°C တွင် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် 19 နာရီကြာသည်။အနီရောင်ရပ်ဝန်းရှိ တစ်ဦးချင်းဖြတ်ကျော်သည့် အထွတ်အထိပ်များနှင့် အပြာရောင်ရောင်စဉ်ရှိ F24၊ G136၊ polyA ကို စာလုံးတစ်လုံးတည်းဖြင့် အမိုင်နိုအက်ဆစ်သင်္ကေတများနှင့် အကြွင်းနံပါတ်များဖြင့် ရည်ညွှန်းသည်။Insets များသည် NT၊ 2Rep နှင့် CT ဒိုမိန်းများမှ ရွေးချယ်ထားသော အကြွင်းအကျန်များအတွက် အချိန်မီ အချက်ပြပြင်းထန်မှုကို ပြသသည်။b His-NT2RepCT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ Solid-state radiofrequency (RFDR) ရောင်စဉ်။RFDR spectra တွင်တွေ့ရှိရသော Cα/Cβ အကြွင်းအကျန်များ၏ဆက်စပ်မှုများကို ကိန်းဂဏန်းစံနှုန်း peptide မှရရှိသော ဓာတုပြောင်းလဲမှုများနှင့် တန်ဖိုးများ နှင့် ၎င်းတို့၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံများမှရရှိသော တန်ဖိုးများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ဆုံးဖြတ်ထားပါသည်။SSB - လှည့်နေသော ဘေးဘောင်။c 37°C တွင် ပေါက်ဖွားစဉ် 36 နာရီကြာ 15N-HSQC 10 mg/mL NT solution ၏ တစ်ဘက်မြင်ရောင်စဉ်။inset သည် အချိန်နှင့် volumetric ပြင်းထန်မှုကို ပြသသည်။d NT ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ အစိုင်အခဲအခြေအနေ RFDR ရောင်စဉ်။Cα/Cβ အကြွင်းအကျန်များနှင့် RFDR spectra တွင်တွေ့ရှိရသော ၎င်းတို့၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံများ ဆက်စပ်မှုများကို ညွှန်ပြသည်။e Zipper ဒေတာဘေ့စ် (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) မှ NT45.79 fibrillation propensity ပရိုဖိုင်ကို အခြေခံထားသည်။hexapeptide ၏ spatial lightning shift window ၏ Rosetta စွမ်းအင်ကို kcal/mol ဖြင့် ပြထားသည်။အနီရောင်ဘားများသည် hexapeptides မြင့်မားသော fibrosis ဉာဉ်ဖြင့်ဖော်ပြသည် (Rosetta စွမ်းအင် -23 kcal/mol အောက်၊ အစက်ချမျဉ်းအောက်)။အစိမ်းရောင်ဘားများသည် တံခါးခုံထက်တွင် Rosetta စွမ်းအင်ရှိသော အပိုင်းအစများကို ညွှန်ပြသောကြောင့် စတီရစ်ဇစ်များ ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်ခြေနည်းသည်။ပရိုလိုင်းပါရှိသောအပိုင်းအစများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ကော်လံများမပါဘဲ) မှဖယ်ထုတ်ထားသည်။လေးထောင့်များသည် Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org) မှ ခန့်မှန်းထားသော amyloidosis ၏ ဧရိယာများကို ဖော်ပြသည်။NT ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ်အကြွင်းအကျန်များ၏ စီစဥ်သည် ထိပ်တွင်ရှိပြီး β အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံ (အစိုင်အခဲ-အခြေအနေ NMR spectroscopy ဖြင့်သတ်မှတ်ထားသည်) တွင်တွေ့ရသော အကြွင်းအကျန်အမျိုးအစားများကို အနီရောင်ဖြင့်ပြသထားသည်။NT α-helices ငါးခု၏ ရာထူးများကို (H1-H5)28 အဖြစ် သတ်မှတ်သည်။
pH <6.5 တွင်၊ HT သည် အပူ- သို့မဟုတ် ယူရီးယား-သွေးဆောင်သော denaturation ဒဏ်ကိုခံနိုင်ရည်ရှိပြီး HT သည် ပျော့သွားပါသည်။NT မှေးမှိန်ခြင်း နှင့် တည်ငြိမ်မှုသည် gelation အကျိုးသက်ရောက်ပုံကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းဖော်ပြရန်အတွက် 100 mg/ml NT ပါရှိသော ဖြေရှင်းချက်များကို vial inversion test ကိုအသုံးပြု၍ pH 8၊ 7 နှင့် 6 တွင် ထိန်းချုပ်ထားသည်။pH 8 နှင့် 7 ဂျယ်သည် 30 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် 30 မိနစ်အကြာတွင်ပေါက်ဖွားပြီးနောက် pH 8 နှင့် 7 ဂျယ်လ်တွင် ပေါက်ဖွားလာသော်လည်း pH 8 gel သည် ကြည်လင်နေသေးသည်၊ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ pH 6 တွင် HT ပါ၀င်သောအဖြေသည် ဂျယ်ပုံစံမဖြစ်ဘဲ 37°C တွင် မိနစ် 20 အကြာတွင် ကြီးမားသောမိုးရေစက်ကိုတွေ့နိုင်သည်။၎င်းသည် ၎င်းတို့ကိုယ်၎င်း မှိန်ဖျော့ခြင်း နှင့်/သို့မဟုတ် ၎င်းတို့၏ မိုနိုမာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မြင့်မားသော တည်ငြိမ်မှုသည် gelation ကို ဟန့်တားကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။pH 7 နှင့် 6 တွင် NT အတွက် precipitate သည် 200 mg/ml27 တွင် ပျော်ဝင်နိုင်သည်ဟု အစီရင်ခံထားပြီးဖြစ်သောကြောင့် NT သည် အပူလွန်ကဲပြီးနောက် အလွယ်တကူ ပြန်ခေါက်နိုင်ပြီး α-helix ကိုလည်း နိမ့်သောတန်ဖိုးများတွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ pH 18။ ဤကွဲလွဲမှုများအတွက် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ရှင်းလင်းချက်မှာ ယခင်က အစီရင်ခံထားသော စမ်းသပ်မှုများကို အခန်းအပူချိန် သို့မဟုတ် အောက်ဖော်ပြပါ သို့မဟုတ် ပရိုတိန်းပါဝင်မှုအတော်လေးနည်းသော 16,18,19 တွင် ပြုလုပ်ခဲ့ခြင်းဖြစ်ပါသည်။
37°C တွင် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် pH 8၊ 7၊ 6 နှင့် 154 mM NaCl (pH 8) တွင် NT vial inversion test (100 mg/mL)။b NT CD spectra နှင့် 154 mM NaF နှင့် 154 mM NaCl တို့ အသီးသီးရှိသည်။222 nm တွင် Molar ellipticity ကို သဘာဝအတိုင်း ခေါက်ထားသော အချိုးအစားသို့ ပြောင်းသည်။c NT ပြောင်းပြန်လှန်စမ်းသပ်မှု (100 mg/mL) NT* (37°C နှင့် 60°C), NTA72R (37°C) နှင့် His-NT-L6 (37°C နှင့် 60°C)။d CD ၏ NT mutants NT*၊ NTA72R နှင့် His-NT-L6။222 nm တွင် Molar ellipticity ကို သဘာဝအတိုင်း ခေါက်ထားသော အချိုးအစားသို့ ပြောင်းသည်။e NTFlSp၊ NTMiSp နှင့် NTMiSp (100 mg/mL) ကို လျှော့ချပေးသည့် ပြောင်းပြန်လှန်စမ်းသပ်မှု။စကေးဘား 5 မီလီမီတာ။f CD အမျိုးအစား NT၊ NTFlSp၊ NTMiSp နှင့် NTMiSp တို့ကို လျှော့ချထားသည်။222 nm တွင် Molar ellipticity ကို သဘာဝအတိုင်း ခေါက်ထားသော အချိုးအစားသို့ ပြောင်းသည်။25°C နှင့် 95°C တွင် NT spectra အပြည့်အစုံကို နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 8 တွင် ပြထားသည်။
ဇီဝကမ္မဗေဒဆားအာရုံစူးစိုက်မှုသည် NT အခွဲများကြားရှိ electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများနှင့် pH18 အောက်သို့ NT လွှဲပြောင်းမှုကို သေးငယ်သွားစေရန် ဆုံးဖြတ်သည်။154 mM NaCl နှင့် NaF တို့သည် gelation ကို အသီးသီး တားစီးနိုင်သည် (ပုံ. 5a၊ b; နောက်ဆက်တွဲ ပုံ. 2b) နှင့် ဤဆားများသည် NT monomers ၏ အပူတည်ငြိမ်မှုကို တိုးစေသည် (ပုံ။ 5b၊ နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 8) .အမှေးမှိန်ခြင်းထက် တည်ငြိမ်မှုမြှင့်တင်ခြင်းသည် ဂျယ်လ်ဖွဲ့စည်းခြင်းကို ဟန့်တားကြောင်းလည်း အကြံပြုထားသည်။
gelation တွင် ပရိုတင်းဓာတ်ကို လျှော့ချခြင်းနှင့် တည်ငြိမ်မှုဆိုင်ရာ အခန်းကဏ္ဍကို ထပ်မံလေ့လာရန်၊ pH28.30 နိမ့်သော monomeric လည်း ကျန်ရှိနေသော mutants နှစ်ခုဖြစ်သည့် NT* နှင့် NTA72R ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။NT* သည် မိုနိုမာ၏ ထင်ရှားသော dipolar charge distribution ကို ပြားသွားအောင်ပြုလုပ်သည့် double charge reversal mutant တစ်ခုဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် dimerization ကိုတားဆီးကာ monomer တည်ငြိမ်မှုကို သိသိသာသာတိုးမြင့်စေသည်။NTA72R သည် အားသွင်းထားသော dipole တစ်ခုဖြစ်သော်လည်း၊ Arg-အစားထိုးထားသော Ala သည် dimer နယ်နိမိတ်တွင် တည်ရှိသောကြောင့် ပြောင်းလဲမှုများသည် dimerization အတွက် လိုအပ်သော subunit အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပါသည်။37°C တွင် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် NT* သည် ဟိုက်ဒရိုဂျယ် မဖွဲ့စည်းဘဲ NTA72R သည် 15 မိနစ်ကြာ မှိန်ဖျော့သော ဂျယ်အဖြစ် ဖြစ်ပေါ်လာသည် (ပုံ. 5c)။NT* နှင့် NTA72R နှစ်ခုစလုံးသည် ပျော့ပြောင်း၍မရသော်လည်း monomer တည်ငြိမ်မှု (ပုံ. 5d) တွင် မတူညီသောကြောင့်၊ ဤရလဒ်များသည် အပူချိန်မြင့်မားသောတည်ငြိမ်မှုမှ NT ကို geling မဖြစ်အောင် ကာကွယ်ပေးသည်ဟု အခိုင်အမာအကြံပြုထားသည်။HT* သည် မြင့်မားသောအပူချိန်တွင် မတည်မငြိမ်ဖြစ်နေသောအခါ (60°C တွင် 8 မိနစ်အကြာ; ပုံ 5c) မှလည်း ၎င်းကို ထောက်ခံသည်။NT တွင် methionine ၏ မြင့်မားသော ပါဝင်မှုသည် သဘာဝအတိုင်း ခေါက်ခြင်းကို အရည်ပျော်စေပြီး Met to Leu အစားထိုး ခြောက်မျိုး (ဤနေရာတွင် His-NT-L6 အဖြစ် ရည်ညွှန်းသည်) သည် NT46 မိုနိုမာကို ပြင်းထန်စွာ တည်ငြိမ်စေကြောင်း ယခင်က ပြသထားသည်။NT ဂျယ်ဖွဲ့စည်းမှုအတွက် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ရှိရန် လိုအပ်သည်ဟု ယူဆချက်အပေါ် အခြေခံ၍ His-NT-L6 တည်ငြိမ်သော mutant သည် 37°C (ပုံ 5c၊ d) တွင် gel မပါရှိကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။သို့သော်၊ His-NT-L6 သည် မိနစ် 60 ကြာ 60°C တွင်ပေါက်ဖွားပြီးသည့်နောက်တွင် ဂျယ်တစ်မျိုးကိုဖွဲ့စည်းခဲ့သည်။
NT ၏ ဘီတာစာရွက်ဖွဲ့စည်းပုံများနှင့် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်များအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲနိုင်မှုစွမ်းရည်သည် အချို့သောဖြစ်သော်လည်း၊အမျိုးမျိုးသော ပိုးအမျိုးအစားများနှင့် ပင့်ကူမျိုးစိတ်များမှ NTs၊ Trichonephila clavipes (NTFlSp) သည် ၎င်းတို့၏ methionine ပါဝင်မှုအတော်လေးနည်းပြီး အပူတည်ငြိမ်မှု မြင့်မားသော်လည်း gels များကိုဖွဲ့စည်းခဲ့သည် (ပုံ။ 5e၊ f နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 2)။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ Araneus ventricosus (NTMiSp) မှ သေးငယ်သော ampullar ပရိုတင်းစပီဒရိုအင်း (NTMiSp) မှ အပူတည်ငြိမ်မှုနှင့် methionine ပါဝင်မှုမြင့်မားသော NT သည် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ မဖွဲ့စည်းနိုင်ခဲ့ပါ (နောက်ဆက်တွဲဇယား 2 နှင့် ပုံ။ 5e၊ f)။နောက်ပိုင်းတွင် intramolecular disulfide နှောင်ကြိုးများ ၂၉၊၄၇ ရှိနေခြင်းနှင့် ဆက်စပ်မှုရှိနိုင်သည်။တသမတ်တည်း၊ NTMiSp ၏ disulfide နှောင်ကြိုးများ လျော့ကျသွားသောအခါ၊ ၎င်းသည် 37°C တွင် ပေါက်ဖွားပြီးနောက် 10 မိနစ် (ပုံ. 5e) တွင် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်တစ်ခု ဖြစ်လာသည်။နိဂုံးချုပ်အနေဖြင့်၊ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်သည် အရေးကြီးသော်လည်း NT မှ ဂျယ်ဖွဲ့စည်းခြင်းအတွက် တစ်ခုတည်းသောစံသတ်မှတ်ချက်မဟုတ်ကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။သက်ဆိုင်ရာဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အခြားအချက်မှာ amyloid fibrils ဖွဲ့စည်းရန် ဉာဉ်နှင့် ဇစ်ဒေတာဘေ့စ်နှင့် Waltz algorithm ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် gels ဖွဲ့စည်းနိုင်မှုနှင့် amyloidogenic ဒေသများပါဝင်မှုအပြင် ခန့်မှန်းထားသော ဒေသများ၏ အတိုင်းအတာအကြား ဆက်စပ်မှုကို ပြသခဲ့သည်။ steric ဇစ်များဖွဲ့စည်းရန်။ဆက်စပ်မှုရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲဇယား 2 နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 9)။
သာယာသောအခြေအနေများအောက်တွင် NT ၏ fibrils နှင့် gels များဖွဲ့စည်းနိုင်မှုစွမ်းရည်သည် NT သည် အခြားသောပရိုတင်းအပိုင်းအစများနှင့်ပေါင်းစပ်ထားသော fusion မိတ်ဖက်များ၏လုပ်ဆောင်မှုအပြည့်ဖြင့် gels ကိုဖွဲ့စည်းနိုင်ဆဲဖြစ်ကြောင်းယူဆချက်တစ်ခုရစေခဲ့သည်။၎င်းကိုစမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ NT ၏ C-terminus တွင် purine nucleoside phosphorylase (PNP) နှင့် အစိမ်းရောင်ချောင်းပရိုတင်း (GFP) တို့ကို မိတ်ဆက်ပေးခဲ့သည်။ရလဒ်များဖြစ်သော ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများကို အီးကိုလီတွင် ဖော်ပြခဲ့သည် (His-NT-GFP နှင့် His-NT-PNP အသီးသီးအတွက် His-NT-GFP နှင့် His-NT-PNP အသီးသီး) အတွက် အလွန်မြင့်မားသော နောက်ဆုံးအထွက်နှုန်း (150 mg/L နှင့် 256 mg/L shake flask ယဉ်ကျေးမှုများ)၊ အခြားပရိုတင်းများအတွက် NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) နှင့် His-NT-PNP (100mg/mL) ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများသည် 37°C တွင် 2 နာရီနှင့် 6.5 နာရီအကြာတွင် gels များဖွဲ့စည်းခဲ့ပြီး အရေးကြီးသည်မှာ GFP အပိုင်းသည် မပြောင်းလဲပါ။gelation ပြီးနောက်တွင်၊ gelation ပြီးနောက်တွင် ကနဦး fluorescence ပြင်းအား၏> 70% ဖြင့် စောင့်ကြည့်လေ့လာသည် (ပုံ။ 6a)။၎င်း၏ NT-PNP ဖြေရှင်းချက်များနှင့် ဂျယ်များတွင် PNP လုပ်ဆောင်ချက်ကို တိုင်းတာရန်၊ သန့်စင်သောပြင်ဆင်မှု၏ အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်သည် ဂျယ်လင်ပြင်းအား စစ်ဆေးမှု၏ စစ်ဆေးမှုအပိုင်းအခြားပြင်ပတွင် ရှိနေသောကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့သည် ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းကို NT နှင့် ရောချရမည်ဖြစ်သည်။0.01 mg/mL His-NT-PNP နှင့် 100 mg/mL NT ပါဝင်သော အရောအနှောဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော ဂျယ်သည် ကြိုတင်မမွေးမြူထားသော နမူနာများ၏ ကနဦးအင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်၏ 65% ကို ထိန်းသိမ်းထားသည် (ပုံ။ 6b)။တိုင်းတာမှုအတွင်း ဂျယ်သည် ကျန်ရှိနေသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 10)။
His-NT-GFP (300 mg/mL) နှင့် His-NT-GFP ဟိုက်ဒရိုဂျယ် (300 mg/mL) ပါ၀င်သော ရောင်ပြန်ဆက်ခြင်းမတိုင်မီနှင့် ပြီးနောက် ဆက်စပ်သော fluorescence ပြင်းထန်မှုအမှတ်များသည် တစ်ဦးချင်း တိုင်းတာမှုများ (n = 3) ကို ပြသသည်)၊ အမှားအယွင်းဘားများသည် စံသွေဖည်မှုကို ပြသသည်။ပျမ်းမျှတန်ဖိုးကို error bars ၏အလယ်တွင် ပြထားသည်။b PNP လုပ်ဆောင်ချက်ကို NT (100 mg/ml) နှင့် 0.01 mg/ml his-NT-PNP နှင့် 100 mg/ml New Taiwan dollar ပါဝင်သော NT (100 mg/ml) ပါဝင်သော ဖြေရှင်းချက်များနှင့် gels များကို အသုံးပြု၍ fluorometric ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ထည့်သွင်းမှုတွင် His-NT-PNP (5 မီလီမီတာ စကေးဘား) ပါရှိသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ပါရှိသော ပြောင်းပြန်ပုလင်းကို ပြသသည်။
ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 37°C (ပုံ 1) တွင် ပရိုတင်းဖြေရှင်းချက်တစ်ခုကို ပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့် NT မှ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များနှင့် အခြားပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော စပစ်ဒရိုရင်းပရိုတင်းများ ဖွဲ့စည်းမှုကို အစီရင်ခံပါသည်။gelation သည် α-helices များကို β-အလွှာများအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခြင်းနှင့် amyloid-like fibrils များဖွဲ့စည်းခြင်း (ပုံ။ 3 နှင့် 4) တို့နှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။NTs များသည် အလွန်မြင့်မားသော ပျော်ဝင်နိုင်စွမ်းနှင့် မြင့်မားသော တည်ငြိမ်မှုအတွက် လူသိများသော ဆံထုံးများဖြစ်ပြီး 200 mg/mL တွင် 4°C တွင် ရက်အတော်ကြာကြာ 200 mg/mL တွင် တည်ငြိမ်မှုမြင့်မားသောကြောင့် NTs များသည် အံ့သြစရာဖြစ်သည်။ထို့အပြင်၊ µM တွင် ပရိုတင်းပါဝင်မှုနည်းသော အပူရှိန်လွန်ကဲပြီးနောက် NTs သည် အလွယ်တကူပြန်ခေါက်သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ fibril ဖွဲ့စည်းမှုသည် > 10 mg/mL ပရိုတင်းဓာတ်ပြင်းအားနှင့် အနည်းငယ်မြင့်မားသောအပူချိန် (ပုံ 1) ပေါင်းစပ်မှုလိုအပ်ပါသည်။48 ဇီဝကမ္မအခြေအနေများအောက်တွင် အပူအတက်အကျများကြောင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ဖြန့်ထုတ်ထားသော ဂလိုဘယ်ခေါက်ပရိုတိန်းများမှ amyloid fibrils သည် ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည်ဟူသော အယူအဆနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ဤပြောင်းလဲခြင်းခံရသော ပရိုတင်းနမူနာများတွင် အင်ဆူလင် 49,50၊ β2-microglobulin၊ transthyretin နှင့် lysozyme51,52,53 ပါဝင်သည်။NT သည် ၎င်း၏ဇာတိပြည်နယ်ရှိ α-helix ဖြစ်သော်လည်း၊ polypeptide ကွင်းဆက်၏ ခန့်မှန်းခြေ 65% သည် steric zipper ဖွဲ့စည်းခြင်း (ပုံ. 4e) 45 နှင့် တွဲဖက်အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။မိုနိုမာသည် အင်တိုက်အားတိုက် မိုဘိုင်း46 ဖြစ်သောကြောင့်၊ ၎င်းသည် ဤအလားအလာရှိသော amyloidogenic ဒေသများကို အတန်အသင့် မြင့်မားသော အပူချိန်တွင် ဖော်ထုတ်နိုင်ပြီး စုစုပေါင်း ပရိုတင်းဓာတ်၏ ပြင်းအားသည် amyloid fibril ဖွဲ့စည်းမှုအတွက် အရေးကြီးသော အာရုံစူးစိုက်မှုသို့ ရောက်ရှိနိုင်သည်54။ဤကျိုးကြောင်းဆင်ခြင်ပြီးနောက်၊ spidroin အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် gelation အချိန် (ပုံ 1c) အကြား အနုတ်လက္ခဏာဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပြီး monomeric NT အသွင်အပြင်ကို ဗီဇပြောင်းလဲမှုများ (NT*၊ His-NT-L6) ဖြင့်သော်လည်းကောင်း ဆားထည့်ခြင်းဖြင့်သော်လည်းကောင်း မတည်ငြိမ်ပါက၊ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ ဖွဲ့စည်းခြင်း (ပုံ။ ၅)။
အခြေအနေအများစုတွင်၊ amyloid fibrils သည် ရွာသွန်းသောအရည်အဖြစ်မှ ပျောက်ကွယ်သွားသော်လည်း အချို့သောအခြေအနေများတွင် ၎င်းတို့သည် hydrogels 55,56,57 အဖြစ် ဖန်တီးနိုင်သည်။Hydrogel-forming fibrils များသည် ပုံမှန်အားဖြင့် မြင့်မားသော ရှုထောင့်အချိုးတစ်ခုရှိပြီး မော်လီကျူးအဆက်အစပ်မှတဆင့် တည်ငြိမ်သော သုံးဖက်မြင် ကွန်ရက်များ ဖြစ်ပေါ်လာသည်၊ 55,58 ကျွန်ုပ်တို့၏ ရလဒ်များနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ဗီရိုအတွင်း ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ဖွဲ့စည်းမှုအတွက်၊ ပရိုတင်းများကို မကြာခဏ သို့မဟုတ် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ဖြန့်ကျက်လေ့ရှိသည်၊ ဥပမာ၊ သြဂဲနစ်ပျော်ဝင်မှုများ၊ မြင့်မားသောအပူချိန် (70–90°C) နှင့်/သို့မဟုတ် pH နိမ့် (1.5–3.0)59,60,61,62 တို့နှင့် ထိတွေ့ခြင်းအားဖြင့်။ဤနေရာတွင်ဖော်ပြထားသော spidroin ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များသည် ပြင်းထန်သောလုပ်ဆောင်မှုမလိုအပ်ပါ၊ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များကိုတည်ငြိမ်စေရန် cross-linking အေးဂျင့်များမလိုအပ်ပါ။
ပိုးချည်နှောင်နေစဉ်အတွင်း ဘီ-စာရွက်ပြောင်းခြင်းခံရသော spidroin သည် ထပ်ခါတလဲလဲနှင့် QDs များကို ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များအဖြစ် ဖွဲ့စည်းထားကြောင်း ယခင်က အစီရင်ခံထားပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ရှာဖွေတွေ့ရှိချက်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပေါက်ဖွားသည့်အချိန်နှင့်/သို့မဟုတ် ပေါက်ဖွားသည့်အပူချိန်သည် သိသိသာသာ ပိုရှည်သည် သို့မဟုတ် အသီးသီးရှိကြပြီး ရလဒ်ထွက်ရှိသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များသည် မကြာခဏ အရောင်တောက်နေပါသည် (ပုံ 7 နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 1) 37၊ 38၊ 63၊ 64၊ 65၊ 66၊ 67၊ 68 69. လျင်မြန်သော gel ကြိမ်များအပြင်၊ NT hydrogels >300 mg/mL (30%) သည် ဖော်ပြထားသော အခြားပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော ပင့်ကူပိုးပရိုတင်း ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များအပြင် gelatin၊ alginate (2%)၊ agar (0.5% ကဲ့သို့ သဘာဝဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ)၊ ) နှင့် ကော်လာဂျင်။(၀.၆%) (ပုံ ၇ နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား ၁ နှင့် ၃) ၃၇၊၃၉၊၆၆၊၆၇၊၆၈၊၆၉၊၇၀၊၇၁၊၇၂၊၇၃၊၇၄။
ဤလေ့လာမှုရှိ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ ဂျယ်လ်အချိန်နှင့် ပျော့ပျောင်းမှု မော်ဒူလပ်များကို အခြား စပီဒရိုရင်းအခြေခံ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များနှင့် ရွေးချယ်ထားသော သဘာဝ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည်။အကိုးအကားများကို gelation အခြေအနေများဖော်ပြချက်နှင့်အတူပေးထားသည်။APS Ammonium persulfate အခန်းအပူချိန်။ဒေတာ ၃၇၊ ၃၈၊ ၃၉၊ ၆၄၊ ၆၅၊ ၆၆၊ ၆၇၊ ၆၈၊ ၆၉၊ ၇၀၊ ၇၁၊ ၇၂၊ ၇၃၊ ၇၄။
ပင့်ကူများသည် သိုလှောင်မှုအတွင်း ပင့်ကူများ ဂျယ်လီခြင်းမှ ကာကွယ်ရန် နည်းလမ်းများကို တီထွင်ခဲ့ကြပုံရသည်။ပိုးသားဂလင်းတွင် ပရိုတင်းဓာတ်ပါဝင်မှု မြင့်မားသော်လည်း၊ terminal domain နှင့် ဆက်စပ်နေသော ကြီးမားသော ထပ်ခါထပ်ခါနေရာသည် ဤလေ့လာမှု၏ နယ်နိမိတ်တွင် NT နှင့် CT ၏ ထင်ရှားသော အာရုံစူးစိုက်မှုသည် ဤလေ့လာမှု၏ နယ်နိမိတ်တွင် 10-20 mg/ml နှင့် သက်ဆိုင်သည်ဟု ဆိုလိုသည်။ဗိုက်ထရိုတွင် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ဖွဲ့စည်းမှုကို စောင့်ကြည့်လေ့လာရန် လိုအပ်သည်။ထို့အပြင်၊ အလားတူဆား 16 သည် ပိုးဂလင်းများတွင်ကဲ့သို့ တည်ငြိမ်စေသည် (ပုံ။ 5b)။NT ၏ဖွဲ့စည်းပုံကို E. coli cytosol တွင်လေ့လာခဲ့ပြီး vitro တွင်စစ်ဆေးသောအခါထက်ပိုမိုတင်းကျပ်စွာခေါက်ထားကြောင်းတွေ့ရှိရပြီးဆားသို့မဟုတ်အခြားအချက်များသည် vivo တွင်၎င်း၏စုစည်းမှုကိုတားဆီးကြောင်းထပ်မံဖော်ပြသည်။သို့သော်၊ NTs ၏ β-sheet fibrils အဖြစ်အသွင်ပြောင်းရန် စွမ်းရည်သည် အမျှင်များဖွဲ့စည်းခြင်းအတွက် အရေးကြီးနိုင်ပြီး အနာဂတ်လေ့လာမှုများတွင် စုံစမ်းစစ်ဆေးသင့်သည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်တွေ့ရှိရသော NT-amyloid-like fibril နှင့် hydrogel ဖွဲ့စည်းမှု၏ ဆန်းသစ်သောသွင်ပြင်လက္ခဏာများအပြင်၊ ဤဖြစ်စဉ်တွင် ဇီဝနည်းပညာနှင့် ဇီဝဆေးဝါးဆိုင်ရာအသုံးချမှုများပါရှိသည် (ပုံ။ 8) ကိုလည်း ပြသထားသည်။အယူအဆသက်သေအဖြစ်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် NT ကို GFP သို့မဟုတ် PNP နှင့် ပေါင်းစပ်ပြီး ပေါင်းစည်းထားသော ပရိုတင်းသည် 37°C တွင် ပေါက်ဖွားသည့်အခါ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်များ ဖွဲ့စည်းကြောင်းနှင့် GFP နှင့် PNP အပိုင်းအစများသည် gelation ပြီးနောက် ၎င်းတို့၏လုပ်ဆောင်မှုကို ကြီးမားစွာထိန်းသိမ်းထားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 6)။Nucleoside phosphorylase များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုကို biopharmaceutical လုပ်ငန်းအတွက် ဆက်စပ်မှုဖြစ်စေသော nucleoside analogues75 ၏အရေးကြီးသောဓာတ်ကူပစ္စည်းပေါင်းစပ်မှုဖြစ်သည်။ကောင်းသောအခြေအနေများအောက်တွင် ဖောက်ထွင်းမြင်ရသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များဖွဲ့စည်းသည့် ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများကို ဖော်ပြခြင်းသဘောတရားသည် အင်ဇိုင်းထိန်းချုပ်မှု၊ ထိန်းချုပ်ဆေးဝါးထုတ်လွှတ်မှုနှင့် တစ်သျှူးအင်ဂျင်နီယာစသည့် ကျယ်ပြန့်သောအသုံးချပရိုဂရမ်များအတွက် နှစ်သက်ဖွယ်ကောင်းသောဂုဏ်သတ္တိများရှိသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များကို ဖန်တီးနိုင်စေပါသည်။ထို့အပြင်၊ NT နှင့် NT* တို့သည် ထိရောက်သော expression markers30 ဖြစ်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ NT နှင့် ၎င်း၏မျိုးကွဲများကို ပျော်ဝင်နိုင်သော ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းများ ထုတ်လုပ်မှုနှင့် 3D ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များတွင် နောက်ဆက်တွဲအဖြစ် ထိန်းညှိထားသော ပစ်မှတ်ပရိုတိန်းများ၏ နောက်ဆက်တွဲဖန်တီးမှုများအတွက် အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
NT သည် ပျော်ဝင်နိုင်သည်၊ α-helical ဖြစ်ပြီး ပြင်းအားနိမ့် (µM) နှင့် 37°C တွင် တည်ငြိမ်သည်။တူညီသောအပူချိန်တွင်၊ သို့သော် ပြင်းအား (> 10 mg/ml) တွင် NT သည် amyloid-like fibrils များပါ၀င်သော ဂျယ်များကိုဖွဲ့စည်းသည်။NT ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများသည် NT ကိုအသုံးပြု၍ 3D ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များတွင် အမျိုးမျိုးသောပရိုတိန်းများကို မလှုပ်မယှက်ဖြစ်စေရန်အတွက် အပြည့်အဝလုပ်ဆောင်နိုင်သော ပေါင်းစည်းမှုအပိုင်းအစများဖြင့် fibrillar gels များအဖြစ်လည်းဖွဲ့စည်းသည်။အောက်ခြေ- NT (PDB: 4FBS) နှင့် ဖိုက်ဘာကွန်ရက်များနှင့် ဆက်စပ်ပရိုတိန်းဖွဲ့စည်းပုံများ၏ ပုံဥပမာများ (ယူဆရပြီး စကေးအရရေးဆွဲထားခြင်းမဟုတ်ပါ၊ GFP PDB- 2B3Q၊ 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB- 4RJ2၊ 10.2210J/pdb4)။
တည်ဆောက်မှုများ (အမိုင်နိုအက်ဆစ်အစီအစဥ်များအပါအဝင် ပြီးပြည့်စုံသောစာရင်းအတွက် နောက်ဆက်တွဲဇယား 4 ကိုကြည့်ပါ) ကို plasmid pT7 အဖြစ်ပုံတူပွားပြီး E. coli BL21 (DE3) အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။အင်ဂျင်နီယာဆိုင်ရာ ပလတ်စမစ်များပါရှိသော အီးကိုလီကို kanamycin (70 mg/l) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော Luria ဟင်းရည်တွင် ထိုးသွင်းပြီး 30°C နှင့် 250 rpm တွင် ညတွင်းချင်း ကြီးထွားလာသည်။ထို့နောက် ယဉ်ကျေးမှုကို 1/100 ကို kanamycin ပါရှိသော LB ကြားခံအဖြစ်သို့ သွင်းပြီး OD600 သည် 0.8 အထိ 30°C နှင့် 110 rpm တွင် မွေးမြူထားသည်။NMR လေ့လာမှုများအတွက်၊ ဘက်တီးရီးယားများသည် D-glucose 13C (Aldrich) နှင့် ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ၏ 2 g ပါဝင်သော D-glucose 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ပါဝင်သော အနိမ့်ဆုံးအလယ်အလတ်တွင် ဘက်တီးရီးယားများကို ကြီးထွားစေပါသည်။အပူချိန်ကို 20 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်သို့ လျှော့ချပြီး 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (နောက်ဆုံး အာရုံစူးစိုက်မှု) ဖြင့် ပရိုတင်းဖော်ပြမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။တစ်ညလုံး ပရိုတင်းဓာတ် ထုတ်လွှတ်ပြီးနောက်၊ ဆဲလ်များကို 7278×g၊ 4°C တွင် မိနစ် 20 ကြာ ရိတ်သိမ်းခဲ့သည်။ဆဲလ်အမှုန့်များကို 20 mM Tris-HCl၊ pH 8 ဖြင့် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီး နောက်ထပ်အသုံးပြုသည်အထိ အေးခဲထားသည်။သုတ်ထားသောဆဲလ်များကို 30 kPa ဖြင့် ဆဲလ် disruptor (TS စီးရီးစက်များ၊ Constant Systems Limited၊ England) ဖြင့် lyse လုပ်ထားပါသည်။ထို့နောက် lysates များကို 25,000 g တွင် 4°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ centrifuged လုပ်ခဲ့သည်။NTMiSp အတွက်၊ ထို့နောက် pellet အား 2 M ယူရီးယား၊ 20 mM Tris-HCl၊ pH 8 တွင် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီး 2 မိနစ် (2 s အဖွင့်/ပိတ်၊ 65%)၊ ထို့နောက် 25,000 xg၊ 4° C. အတွင်းတွင် centrifuged ထပ်မံပြုလုပ်သည်။ 30 မိနစ်supernatant ကို Ni-NTA ကော်လံတစ်ခုပေါ်တင်ပြီး 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 ဖြင့် ဆေးကြောပြီး နောက်ဆုံးတွင် ပရိုတင်းကို 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8 ဖြင့် ဖယ်ထုတ်ခဲ့သည်။ NT2RepCT ထုတ်လုပ်ရန်နှင့်၊ NTCT၊ thrombin အစာခြေခြင်းသည် သူနှင့် NT ကြားရှိ site (ThrCleav) ကိုမိတ်ဆက်ပေးသည်။Thrombin ကွဲထွက်သည့်နေရာများသည် His-NT-ThrCleav-2Rep (ထုတ်လုပ်သည့် 2Rep)၊ His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ထုတ်လုပ်သည့် NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ထုတ်လုပ်သည့် CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT တို့တွင်လည်း ရှိနေပါသည်။ .* (NT* ကို ထုတ်လုပ်ပေးသည်)၊ His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ထုတ်လုပ်သည်)၊ His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ကိုထုတ်လုပ်သည်) နှင့် His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (ထုတ်လုပ်သည်)။တည်ဆောက်မှုများကို thrombin (1:1000) ဖြင့် ချေဖျက်ပြီး 4°C တွင် 20 mM Tris-HCl, pH 8 ဖြင့် Spectra/Por dialysis membrane ကို အသုံးပြု၍ မော်လီကျူးအလေးချိန်အဆင့် 6-8 kDa ဖြင့် တစ်ညလုံး အောင်ဆေးပေးသည်။dialysis ပြီးနောက်၊ အဖြေအား Ni-NTA ကော်လံပေါ်တွင် တင်ကာ အကျိုးစီးပွားရှိသော ပရိုတင်းဓာတ်ပါ၀င်သော အညစ်အကြေးများကို စုဆောင်းသည်။ထုတ်လုပ်သူ၏ပရိုတိုကောအရ Bradford assay ကိုအသုံးပြုထားသည့် NTF1Sp မှလွဲ၍ ပရိုတင်းဓာတ်ပါဝင်မှုအား 280 nm တွင် UV စုပ်ယူမှုကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်သည်။သန့်စင်မှုကို SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis နှင့် Coomassie တောက်ပသော အပြာရောင် စွန်းထင်းခြင်းတို့ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ပရိုတင်းများကို မိနစ် 20 ပတ်လုံးအတွင်း 10 kDa မော်လီကျူးအလေးချိန်ဖြတ်တောက်ခြင်းဖြင့် 4000 xg တွင် centrifuge filter (VivaSpin 20၊ GE Healthcare) ကိုအသုံးပြု၍ စုစည်းထားပါသည်။
ပရိုတင်းအရည်ကို ရောပြီး 150 µl ကို ကြည်လင်သော septum vial (8 x 40 mm Thermo Scientific) ထဲသို့ ဂရုတစိုက် ပိုက်ထည့်ပါ။အငွေ့ပျံခြင်းမှ ကာကွယ်ရန် ပြွန်များကို ဖုံးအုပ်ထားပြီး parafilm ဖြင့် အလုံပိတ်ထားသည်။နမူနာများ (n = 3) ကို 37°C သို့မဟုတ် 60°C တွင် ပေါက်ဖွားပြီး gelation ကို စောင့်ကြည့်ရန် အခါအားလျော်စွာ ပြောင်းပြန်လှန်ထားသည်။ဂျယ်မပါသော နမူနာများကို အနည်းဆုံး တစ်ပတ်ကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။10 µM ပရိုတင်းနှုန်း 10 mM DTT ဖြင့် NTMiSp disulfide နှောင်ကြိုးများကို လျှော့ချပါ။သဘာဝပင့်ကူပိုးသားအပေါ်ယံပိုင်း၏ gelation ကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်၊ ဆွီဒင်တံတားပင့်ကူကိုဖြတ်တောက်ခဲ့ပြီး၊ ပင်မစုပ်ထုတ်ထားသောဂလင်းနှစ်ခုကို 20 mM Tris-HCl ကြားခံ pH 8 ၏ 200 μl တွင်ထားရှိကာ အပေါ်ယံအလွှာကို ဂလင်းများမှခွဲထုတ်ခွင့်ပြုရန် ဖြတ်တောက်ခဲ့သည်။.ဂလင်းများ၏ပါဝင်ပစ္စည်းများကို ခြောက်သွေ့သောအလေးချိန်သတ်မှတ်ရန်အတွက် 50 µl (အပူချိန် 60 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်မှ အဆက်မပြတ်အလေးချိန်အထိ) ဖန်ပုလင်းများကို ပေါက်ပွားခြင်းဖြင့် 50 µl နှင့် 37°C တွင် gelation အတွက် 150 µl တို့ဖြစ်သည်။
ဂျီသြမေတြီ တိုင်းတာခြင်း/ကိရိယာအား ထိပ်အချင်း 20 မီလီမီတာနှင့် ကွာဟချက် 0.5 မီလီမီတာရှိသော အပြိုင်ပန်းကန်ကို အသုံးပြု၍ သံမဏိဖြင့် ပြုလုပ်ထားသည်။နမူနာအား 25°C မှ 45°C အထိ အပူပေးပြီး တစ်မိနစ်လျှင် 1°C နှုန်းဖြင့် Stainless Steel အောက်ခြေ Peltier ပန်းကန်ပြားကို အသုံးပြု၍ အပူပေးပါ။တုန်ခါမှုတိုင်းတာခြင်းများကို 100 mg/mL နှင့် 300–500 mg/mL နမူနာများအတွက် 5% နှင့် 0.5% တို့တွင် ပစ္စည်း၏ linear viscoelastic ဧရိယာအတွင်း တုန်ခါမှုတိုင်းတာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ရေငွေ့ပျံခြင်းကို ကာကွယ်ရန် စိတ်ကြိုက် စိုထိုင်းဆ အခန်းကို အသုံးပြုပါ။ဒေတာကို Prism 9 သုံးပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
အခန်းအပူချိန် 800 မှ 3900 စင်တီမီတာမှ 1 တွင် အနီအောက်ရောင်ခြည် (IR) spectra စုဆောင်းခြင်းအတွက်။ATR ကိရိယာအပြင် spectrometer မှတဆင့် အလင်းလမ်းကြောင်းကို စမ်းသပ်မှုမပြုမီနှင့် ကာလအတွင်း ခြောက်သွေ့သောလေဖြင့် သန့်စင်ထားသည်။ဖြေရှင်းချက် (500 mg/mL) သည် ပုံဆောင်ခဲများပေါ်သို့ ရေစုပ်ယူမှုကို လျှော့ချရန်၊ တိုင်းတာခြင်းမပြုမီ ဂျယ်များ (500 mg/mL) ကို ဖွဲ့စည်းပြီးနောက် ပုံဆောင်ခဲများ (n = 3) သို့ လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။1,000 စကင်န်ဖတ်မှုများကို ကြည်လင်ပြတ်သားမှု 2 စင်တီမီတာ-1 နှင့် 2 ၏ သုညဝတ္တရားစက်ဝန်းဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ ဒုတိယမြောက်ဆင်းသက်မှုကို OPUS (Bruker) ဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” ကို အသုံးပြု၍ 1720 နှင့် 1580 စင်တီမီတာ-1 အကြား တူညီသော ပေါင်းစပ်ဧရိယာသို့ ပုံမှန်ပြုလုပ်ထားသည်။ATR-IR spectroscopy တွင်၊ နမူနာတစ်ခုသို့ အနီအောက်ရောင်ခြည်ဖြာထွက်မှုအတိမ်အနက်သည် လှိုင်းနံပါတ်ပေါ်တွင် မူတည်ပြီး လှိုင်းနံပါတ်များထက် မြင့်မားသော လှိုင်းနံပါတ်များထက် နိမ့်သော လှိုင်းများကို ပိုမိုအားကောင်းစွာ စုပ်ယူနိုင်စေသည်။Fig တွင်ပြသထားသည့် ရောင်စဉ်များအတွက် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ပြုပြင်မထားပါ။3 ၎င်းတို့သည် အလွန်သေးငယ်သောကြောင့် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 4)။Bruker OPUS ဆော့ဖ်ဝဲလ်ကို အသုံးပြု၍ ဤကိန်းဂဏန်းအတွက် ပြုပြင်ထားသော ရောင်စဉ်ကို တွက်ချက်ထားသည်။
အခြေခံအားဖြင့်၊ amide I peak အတွင်းမှ အစိတ်အပိုင်းများကို ယုံကြည်စိတ်ချရသော အစိတ်အပိုင်းများ ပြိုကွဲပြီးနောက် ပရိုတိန်းပုံစံများ ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ပမာဏကို အတိုင်းအတာတစ်ခုအထိ ဖြစ်နိုင်သည်။သို့သော် လက်တွေ့တွင် အတားအဆီးအချို့ရှိသည်။deconvolution ကာလအတွင်း spectrum အတွင်းရှိ ဆူညံသံ (false) peaks အဖြစ် ပေါ်လာနိုင်သည်။ထို့အပြင်၊ ရေကွေးမှုကြောင့် တောင်ထွတ်သည် amide I peak ၏ အနေအထားနှင့် တိုက်ဆိုင်ပြီး ဤနေရာတွင် လေ့လာခဲ့သော aqueous gel ကဲ့သို့သော ရေပမာဏများစွာပါဝင်သော နမူနာများအတွက် အလားတူပြင်းအားရှိနိုင်သည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် amide I peak ကို လုံးဝပြိုကွဲစေရန် မကြိုးပမ်းခဲ့ဘဲ၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာတွေ့ရှိချက်များကို NMR spectroscopy ကဲ့သို့သော အခြားနည်းလမ်းများဖြင့်သာ ထည့်သွင်းစဉ်းစားသင့်ပါသည်။
50 mg/ml NT နှင့် His-NT2RepCT ၏ဖြေရှင်းချက်များအား 37°C တွင် တစ်ညလုံး ဂျယ်လီထုတ်ခဲ့သည်။ထို့နောက် ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ကို 20 mM Tris-HCl (pH 8) နှင့် ပြင်းအား 12.5 mg/ml သို့ ရောနှောကာ ကောင်းစွာ လှုပ်ခါပြီး ဂျယ်ကို ကွဲစေရန် ပိုက်ထည့်သည်။ထို့နောက်၊ ဟိုက်ဒရိုဂျယ်ကို 20 mM Tris-HCl (pH 8) ဖြင့် 10 ကြိမ်ဖျော်ပြီး နမူနာ၏ 5 μl ကို formvar ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော ကြေးနီဂရစ်ကွက်တစ်ခုသို့ အသုံးချကာ ပိုလျှံသောနမူနာကို စက္ကူစုတ်စက္ကူဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။နမူနာများကို MilliQ ရေ 5 µl ဖြင့် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောပြီး 1% uranyl formate ဖြင့် 5 မိနစ်ကြာ စွန်းထင်းခဲ့သည်။ပိုနေတဲ့ အစွန်းအထင်းတွေကို စုပ်ယူထားတဲ့ စက္ကူနဲ့ ဖယ်ရှားပြီးနောက် ကွက်လပ်ကို လေနဲ့ အခြောက်ခံပါ။100 kV တွင် လုပ်ဆောင်နေသော FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ကို အသုံးပြု၍ ဤဂရစ်များပေါ်တွင် ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ပုံများကို Veleta 2k × 2k CCD ကင်မရာ (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) ဖြင့် x 26,500 နှင့် x 43,000 ပုံများကို မှတ်တမ်းတင်ထားပါသည်။နမူနာတစ်ခုစီအတွက် (n=1)၊ 10-15 ပုံများကို မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ကို ရုပ်ပုံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းနှင့် ဖိုင်ဘာအချင်းများ (n = 100၊ ကွဲပြားသောဖိုင်ဘာများ) အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။Prism 9 ကို တွဲမထားသည့် t-tests (အမြီးနှစ်ကြောင်း) လုပ်ဆောင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ပျမ်းမျှ His-NT2RepCT နှင့် NT fibrils တို့သည် 11.43 (SD 2.035) နှင့် 7.67 (SD 1.389) nm အသီးသီးဖြစ်သည်။ယုံကြည်မှုကြားကာလ (95%) သည် -4.246 မှ -3.275 ဖြစ်သည်။လွတ်လပ်မှုဒီဂရီ = 198၊ p < 0.0001။
10 µM thioflavin T (ThT) ပါ၀င်သော အရည်နမူနာများကို Corning 96-ကောင်းစွာအနက်ရောင်အောက်ခြေအကြည်အောက်ခြေပြားများ (Corning Glass 3881, USA) အသုံးပြု၍ တည်ငြိမ်သောအခြေအနေအောက်တွင် triplicate (n = 3) ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။Fluorescence ကွဲပြားမှုများကို 440 nm excitation filter နှင့် 480 nm emission filter (BMG Labtech၊ Offenburg၊ Germany) မှ FLUOStar Galaxy တို့ကို အသုံးပြု၍ မှတ်တမ်းတင်ထားပါသည်။ကွဲပြားသော ThT ၏ပြင်းအားများနှင့် စမ်းသပ်မှုများသည် အချက်ပြမှုပြင်းထန်မှုကို မပြောင်းလဲဘဲ ပြုလုပ်သောကြောင့် ThT အချက်ပြမှုမှာ ပြည့်နှက်နေသည် သို့မဟုတ် မီးမငြိမ်းနိုင်ပါ။မြူမှုန်များကို တိုင်းတာရန်အတွက် 360 nm တွင် စုပ်ယူမှု မှတ်တမ်းတင်ခြင်း။မျိုးစေ့စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ 100 mg/mL gels များကို 37°C. တွင်ဖွဲ့စည်းထားပြီး၊ ရပ်ဆိုင်းပြီး အံအချိုး 5%, 10%, နှင့် 20% တွင် မျိုးစေ့အတွက်အသုံးပြုသည်။ဒေတာကို Prism 9 သုံးပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
His-NT2RepCT နှင့် NT >100 mg/mL ၏စတော့များကို ရေခဲပေါ်တွင် ရောချပြီး 0.22 µm ဇကာဖြင့် စစ်ထုတ်ပါ။Nanodrop ကို အသုံးပြု၍ စုပ်ယူမှုကို 280 nm တွင် တိုင်းတာခြင်းဖြင့် အာရုံစူးစိုက်မှုကို တွက်ချက်သည်။အောက်ခြေတွင် ရှင်းလင်းသော 96-ကောင်းစွာအနက်ရောင် ချိတ်မပါသောပန်းကန် (Corning) ၏ ရေတွင်းများတွင် နမူနာများကို 20 mM Tris-HCl pH 8 တွင် 20 mg/ml သို့ 20 mM Tris-HCl pH 8 ဖြင့် ရောစပ်ပြီး 5 μM ThT (နောက်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှု) နှင့် စုစုပေါင်းနမူနာပြင်းအား၊ 50 μl ထုထည်။နမူနာများကို 37°C တွင် 10 မိနစ်တိုင်းတွင် ထုတ်လွှင့်သော အလင်းချန်နယ်နှင့် ThT ပုံရိပ်အတွက် FITC လှုံ့ဆော်မှု နှင့် ထုတ်လွှတ်မှု စစ်ထုတ်မှုအစုံပါရှိသော CellObserver (Zeiss) အဏုစကုပ်ပေါ်တွင် ပုံပြပါသည်။ပုံရိပ်ဖော်ရန်အတွက် 20x/0.4 မှန်ဘီလူးကို အသုံးပြုထားသည်။ရုပ်ပုံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် Zen Blue (Zeiss) နှင့် ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။20 mM Tris pH 8 နှင့် 5 µM ThT ပါဝင်သော NT နှင့် His-NT2RepCT ဖြေရှင်းနည်းများမှလည်း 50 mg/mL ဖြင့် ပြင်ဆင်ပြီး 37°C တွင် မိနစ် 90 ဖုတ်ထားသည်။ဂျယ်လ်အပိုင်းအစများကို 20 mM Tris၊ pH 8 နှင့် 5 μM ThT ပါဝင်သော ရေတွင်းအသစ်တစ်ခုသို့ လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။20x/0.4 ချဲ့ထွင်မှုဖြင့် အစိမ်းရောင်မီးချောင်းနှင့် တောက်ပသော အကွက်ပုံများကို ရယူပါ။ImageJ ကို ရုပ်ပုံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။
ဖြေရှင်းချက် NMR spectra ကို 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer ဖြင့် QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) ဖြင့် 310 K ဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။13C၊ 15N ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသော 10 mg/mL တစ်သားတည်းသော ပရိုတင်းများပါရှိသော NMR နမူနာများ၊ 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .pH 6.7 တွင် NT2RepCT ၏ ဓာတုပြောင်းလဲမှုများကို 15N-HSQC ၏ 2D spectrum တွင် peak 23 ကို သတ်မှတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။
3.2 မီလီမီတာ 13C/15N{1H} အီလက်ထရွန်မဲ့ စုံစမ်းစစ်ဆေးမှု တပ်ဆင်ထားသော Bruker Avance III HD spectrometer တွင် 13C၊ 15N-တံဆိပ်တပ်ထားသော ဟိုက်ဒရိုဂျယ်များ၏ မှော်ထောင့်လှည့်နေသော အစိုင်အခဲ NMR (MAS) ရောင်စဉ်ကို မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။နမူနာအပူချိန်ကို 277 K တွင် ပြောင်းလဲနိုင်သော အပူချိန်ဓာတ်ငွေ့စီးကြောင်းကို အသုံးပြု၍ ထိန်းချုပ်ထားသည်။ နှစ်ဖက်မြင် dipole rotational resonance (DARR)76 နှင့် radio frequency reconnection (RFDR)77 spectra ကို MAS frequencies 12.5 kHz နှင့် 20 kHz အသီးသီးဖြင့် ရယူခဲ့သည်။1H မှ 13C မှ Cross polarization (CP) ကို 1H တွင် 60.0 မှ 48.0 kHz ၊ 13C တွင် 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS) နှင့် ထိတွေ့ချိန် 0.5–1 ms တွင် မျဉ်းတန်းချဉ်းကပ်လမ်းကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဒေတာစုဆောင်းစဉ်တွင် Spinal6478 ကို 73.5 kHz တွင် ဖယ်ထုတ်ခြင်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ဝယ်ယူချိန်သည် 10 မီလီစက္ကန့်ဖြစ်ပြီး စက်ဝန်းနှောင့်နှေးမှုသည် 2.5 စက္ကန့်ဖြစ်သည်။RFDR spectra တွင်တွေ့ရှိရသော single-linked Cα/Cβ ဆက်စပ်ဆက်နွှယ်မှုများကို DARR spectra ရှိ အကြွင်းအကျန်အမျိုးအစား ဓာတုပြောင်းလဲမှုများနှင့် များပြားသောချိတ်ဆက်ဆက်စပ်မှုများကို အခြေခံ၍ တာဝန်ပေးအပ်ခဲ့သည်။
Zipper79 ဒေတာဘေ့စ် (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ကို NT၊ NTFlSp နှင့် NTMiSp အတွက် တုန်လှုပ်ဖွယ်သဘောထားများနှင့် Rosetta စွမ်းအင်ကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။Zipper ဒေတာဘေ့စ်သည် Rosetta Energy80 ကိုတွက်ချက်ပြီး ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံအား စံနမူနာပြုကာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် အခမဲ့စွမ်းအင်လုပ်ဆောင်ချက်များစွာကို ပေါင်းစပ်ထားသည်။စွမ်းအင်အဆင့် -23 kcal/mol သို့မဟုတ် နိမ့်ပါက fibrillate ဖြစ်နိုင်ခြေ မြင့်မားသည်ကို ညွှန်ပြသည်။အောက်စွမ်းအင်သည် ဇစ်ပုံစံရှိ β-strand နှစ်ခု၏ တည်ငြိမ်မှုကို ဆိုလိုသည်။ထို့အပြင်၊ Waltz algorithm ကို NT၊ NTFlSp နှင့် NTMiSp Ref တို့တွင် amyloidogenic ဒေသများကို ခန့်မှန်းရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။81. (https://waltz.switchlab.org/)။
NT ပရိုတင်းရည်ကို pH 6 နှင့် 7 သို့ အသီးသီး လျှော့ချရန် pH 5.5 နှင့် 6.0 တွင် 2-(N-morpholino) Ethanesulfonic acid (MES) ကြားခံနှင့် ရောစပ်ထားပါသည်။နောက်ဆုံးပရိုတင်းပမာဏသည် 100 mg/ml ဖြစ်သည်။
တိုင်းတာမှုများကို J-1500 CD spectrometer (JASCO၊ USA) တွင် 300 μL cuvette ကို အသုံးပြု၍ optical path of 0.1 cm.ပရိုတိန်းများကို 20 mM ဖော့စဖိတ်ကြားခံ (pH 8) တွင် 10 μM (n = 1) သို့ ရောချခဲ့သည်။ဆားပါဝင်မှုတွင် ပရိုတင်းတည်ငြိမ်မှုကို ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာရန်၊ 154 mM NaF သို့မဟုတ် NaCl အသီးသီးပါဝင်သော 20 mM ဖော့စဖိတ်ကြားခံ (pH 8) တွင် ပရိုတင်းများကို တူညီသောအာရုံစူးစိုက်မှု (n=1) တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။အပူချိန်စကန်ဖတ်မှုများကို 222 nm တွင် 25°C မှ 95°C အထိ အပူပေးနှုန်း 1°C/min ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားပါသည်။မူရင်းခေါက်ထားသော ပရိုတင်းများ၏ အချိုးအစားကို ဖော်မြူလာ (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) ဖြင့် တွက်ချက်ထားပါသည်။ထို့အပြင်၊ နမူနာတစ်ခုစီအတွက် 260 nm မှ 190 nm မှ 25°C နှင့် အပူပေးပြီးနောက် 95°C မှ spectra ငါးခုကို မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ရောင်စဉ်ငါးခုကို ပျမ်းမျှအားဖြင့်၊ ချောမွေ့စေပြီး အံသွား ellipticity အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ဒေတာကို Prism 9 သုံးပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
တည်ငြိမ်သောအခြေအနေအောက်တွင် His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ၏ အလင်းရောင်ပြင်းအား 96- well Corning ပြားများတွင် triplicate (n = 3) ဖြင့် တိုင်းတာထားပါသည်။လှုံ့ဆော်မှုလှိုင်းအလျား 395 nm ဖြင့် fluorescence-based plate reader ဖြင့် နမူနာများကို တိုင်းတာပြီး 509 nm တွင် gelation မလုပ်မီနှင့် 2 နာရီအကြာတွင် 37°C တွင် မှတ်တမ်းတင်ပါ။ဒေတာကို Prism 9 ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
Purine nucleoside phosphorylase လုပ်ဆောင်ချက် စမ်းသပ်ကိရိယာ (fluorometric နည်းလမ်း၊ Sigma Aldrich) ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်အရ အသုံးပြုခဲ့သည်။His-NT-PNP ပါရှိသော ဂျယ်များနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်များကို တိုင်းတာရန်၊ His-NT-PNP ၏ 10 ng ကို 100 mg/mL NT နှင့် စုစုပေါင်း ထုထည် 2 µL သို့ ရောနှောပြီး ဂျယ်သည် သတ်မှတ်ချိန်၏ ထောက်လှမ်းမှုကြားကာလ အထက်တွင် အချက်ပြပေးသောကြောင့် ဖြစ်သည်။His-NT-PNP မပါဘဲ ဂျယ်လ်များနှင့် ဖြေရှင်းချက်များအတွက် ထိန်းချုပ်မှုများ ပါဝင်ပါသည်။တိုင်းတာမှုများ (n = 2) နှစ်ကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။လုပ်ဆောင်ချက်ကို တိုင်းတာပြီးနောက်၊ တုံ့ပြန်မှုအရောအနှောကို ဖယ်ရှားပြီး ဂျယ်ကို တိုင်းတာမှုအတွင်း ဂျယ်ကျန်ရှိနေကြောင်း သေချာစေရန် ဓာတ်ပုံရိုက်သည်။ဒေတာကို Prism 9 သုံးပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
လေ့လာမှုဒီဇိုင်းဆိုင်ရာ နောက်ထပ်အချက်အလက်များအတွက်၊ ဤဆောင်းပါးနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Nature study abstract ကို ကြည့်ပါ။
ပုံ 1 နှင့် 2 သည် ကနဦးဒေတာကို တင်ပြသည်။1c၊ 2a–c၊ 3a၊ b၊ e-g၊ 4၊ 5b၊ d၊ f၊ နှင့် 6၊ နောက်ဆက်တွဲ ပုံများ။၃၊ ဖြည့်စွက်စာ။5a၊ d၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ။6 နှင့်နောက်ဆက်တွဲသင်္ဘောသဖန်းသီး။8. ဤလေ့လာမှုမှဒေတာဒေတာကို Zenodo ဒေတာဘေ့စ် https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 တွင် လက်ခံထားသည်။ဤလေ့လာမှုတွင်ရရှိသော NMR ဒေတာကို ဝင်ခွင့် ID bmrbig36 အောက်ရှိ BMRBig သိုလှောင်ခန်းသို့ ပို့စ်တင်ခဲ့သည်။GFP နှင့် PNP ၏ ဖွဲ့စည်းပုံများကို PDB (GFP 2B3Q၊ PNP 4RJ2) မှ ထုတ်ယူခဲ့သည်။
A. and Johansson, J. Spinning ပင့်ကူအတုပိုးအမျိုးသား ဓာတုဗေဒ။ဇီဝဗေဒ။၁၁၊ ၃၀၉–၃၁၅ (၂၀၁၅)။
Babb, PL et al.Nephila clavipes ဂျီနိုမ်သည် ပင့်ကူပိုးမျိုးရိုး၏ ကွဲပြားမှုနှင့် ၎င်းတို့၏ ရှုပ်ထွေးသောအသုံးအနှုန်းတို့ကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။အမျိုးသား Genette49၊ 895–903 (2017)။