304 stainless steel coil tubing ဓာတုအစိတ်အပိုင်း၊ SPACA6 ectodomain ၏ဖွဲ့စည်းပုံသည် gamete fusion နှင့်ဆက်စပ်သော ထိန်းသိမ်းထားသော superfamily ပါ၀င်သည်။

Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်သည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။
ဆလိုက်တစ်ခုလျှင် ဆောင်းပါးသုံးပုဒ်ကို ပြသသည့် ဆလိုက်ဒါများ။ဆလိုက်များတစ်လျှောက် ရွှေ့ရန် နောက်ဘက်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် ဆလိုက်တစ်ခုစီကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ထိန်းချုပ်မှုခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။

SPACA6 သည် နို့တိုက်သတ္တဝါတို့၏ လိင်မျိုးပွားစဉ်အတွင်း gamete ပေါင်းစပ်မှုအတွက် အရေးပါသော သုတ်ပိုး-ထုတ်ထားသော မျက်နှာပြင်ပရိုတိန်းဖြစ်သည်။ဤအခြေခံအခန်းကဏ္ဍရှိသော်လည်း SPACA6 ၏ သီးခြားလုပ်ဆောင်ချက်ကို နားမလည်နိုင်ပါ။ကျွန်ုပ်တို့သည် 2.2 Å ကြည်လင်ပြတ်သားမှုဖြင့် SPACA6 ၏ extracellular domain ၏ ပုံဆောင်ခဲဖွဲ့စည်းပုံအား ရှင်းရှင်းလင်းလင်းဖော်ပြပြီး ကြိုးလေးချောင်းပါသော အစုအဝေးတစ်ခုနှင့် တစ်ပိုင်းပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ရှိသော ချိတ်ဆက်သူများဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Ig-like β-sandwiches နှစ်ခု-ဒိုမိန်းပရိုတင်းကို ဖော်ထုတ်ပြသပါသည်။ဤဖွဲ့စည်းပုံသည် IST superfamily အဖြစ် ရည်ညွှန်းထားသော မျိုးအောင်ခြင်း-ဆက်စပ်ပရိုတိန်းများ၏ စူပါfamily ၏ SPACA6 နှင့် IZUMO1 ကို စတင်တည်ထောင်သူ အခြား gamete ပေါင်းစပ်-ဆက်စပ်ပရိုတိန်း၊ IZUMO1၊ နှင့် ဆင်တူသည်။IST superfamily ကို ၎င်း၏လိမ်ထားသော helix လေးခုတွဲနှင့် disulfide-linked CXXC motifs တစ်စုံဖြင့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံအရ သတ်မှတ်ထားသည်။လူ့ပရိုတီအို၏ တည်ဆောက်ပုံအခြေခံ AlphaFold ရှာဖွေမှုတစ်ခုသည် ဤ superfamily ၏ နောက်ထပ်ပရိုတိန်းအဖွဲ့ဝင်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။အထူးသဖြင့် ဤပရိုတင်းများစွာသည် gamete ပေါင်းစပ်မှုတွင် ပါဝင်ပါသည်။SPACA6 ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် IST superfamily ၏ အခြားအဖွဲ့ဝင်များနှင့် ၎င်း၏ဆက်ဆံရေးသည် ကျွန်ုပ်တို့၏နို့တိုက်သတ္တဝါ gamete ပေါင်းစပ်မှုအသိပညာတွင် ပျောက်ဆုံးနေသောလင့်ခ်ကို ပေးဆောင်ပါသည်။
လူ့ဘဝတိုင်းသည် သီးခြား haploid gametes နှစ်ခုဖြင့် စတင်သည်- ဖခင်၏သုတ်ပိုးနှင့် မိခင်၏မျိုးဥတို့ဖြစ်သည်။ဤသုတ်ပိုးသည် သန်းပေါင်းများစွာသော သုက်ပိုးဆဲလ်များ အမျိုးသမီးအင်္ဂါလမ်းကြောင်းကို ဖြတ်သွားကာ အမျိုးမျိုးသောအတားအဆီးများကို ကျော်လွှားကာ မျက်နှာပြင်အစိတ်အပိုင်းများ ရွေ့လျားမှုနှင့် မျက်နှာပြင်အစိတ်အပိုင်းများ 2,3,4 ဖြစ်စဉ်ကို မြှင့်တင်ပေးသည့် ဤသုတ်ပိုးသည် ပြင်းထန်သောရွေးချယ်ရေးလုပ်ငန်းစဉ်၏ အနိုင်ရသူဖြစ်သည်။သုက်ပိုးနှင့် oocyte အချင်းချင်းတွေ့လျှင်ပင် လုပ်ငန်းစဉ်မပြီးသေးပါ။oocyte သည် cumulus ဆဲလ်အလွှာနှင့် zona pellucida ဟုခေါ်သော glycoprotein အတားအဆီးဖြင့် ဝန်းရံထားပြီး သုက်ပိုးသည် oocyte အတွင်းသို့ ဝင်ရောက်ရန် ဖြတ်သန်းရမည်ဖြစ်သည်။Spermatozoa သည် ဤနောက်ဆုံးအတားအဆီးများကို ကျော်လွှားရန် မျက်နှာပြင် ကပ်တွယ်မှု မော်လီကျူးများနှင့် အမြှေးပါးဆိုင်ရာ ဆက်စပ်နေသော လျှို့ဝှက်အင်ဇိုင်းများ ပေါင်းစပ်အသုံးပြုသည်။ဤမော်လီကျူးများနှင့် အင်ဇိုင်းများကို အဓိကအားဖြင့် အတွင်းအမြှေးပါးနှင့် acrosomal matrix တွင် သိမ်းဆည်းထားပြီး acrosomal တုံ့ပြန်မှုအတွင်း သုက်ပိုး၏အပြင်ဘက်အမြှေးပါးကို lysed ဖြစ်နေသောအခါတွင် တွေ့ရှိရသည်။ဤပြင်းထန်သောခရီး၏နောက်ဆုံးအဆင့်မှာ ဆဲလ်နှစ်ခုသည် ၎င်းတို့၏အမြှေးပါးများကို ပေါင်းစည်းထားသည့် သုတ်ပိုး-ဥပေါင်းစပ်မှုဖြစ်စဉ်ဖြစ်သည်။ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် လူသားမျိုးပွားခြင်းတွင် အထွတ်အထိပ်ဖြစ်သော်လည်း လိုအပ်သော မော်လီကျူး အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို နားမလည်နိုင်ပေ။
gametes များ မျိုးအောင်ခြင်းအပြင် lipid bilayers နှစ်ခု၏ ပေါင်းစပ်မှု ဓာတုဗေဒကို အကျယ်တဝင့် လေ့လာခဲ့သည်။ယေဘူယျအားဖြင့်၊ အမြှေးပါးပေါင်းစပ်ခြင်းသည် အမြှေးပါးနှစ်ခုကို ပိုမိုနီးကပ်စေပြီး ၎င်းတို့၏အဆက်ပြတ်မှုနှင့် ပေါင်းစပ်မှု 8,9 ကိုဖြစ်စေသော အသွင်သဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုကိုခံယူရန် ပရိုတင်းဓာတ်ကူပစ္စည်းတစ်ခုလိုအပ်သော အားသွန်ခွန်စိုက်မဖြစ်နိုင်သော လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ဤပရိုတိန်းဓာတ်ကူပစ္စည်းကို fuogens ဟုခေါ်ပြီး မရေမတွက်နိုင်သော ပေါင်းစပ်စနစ်များတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။၎င်းတို့သည် အိမ်ရှင်ဆဲလ်များအတွင်းသို့ ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးဝင်ရောက်ခြင်းအတွက် လိုအပ်သည် (ဥပမာ- HIV-1 တွင် gp160၊ ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များ တိုးလာခြင်း၊ တုပ်ကွေးဗိုင်းရပ်စ်များတွင် ဟီမာဂလူတင်နင်) 10,11,12 placental (syncytin) 13,14,15 နှင့် အောက်ပိုင်း ယူကရီရိုတွင် gamete-forming fusions ( အပင်များ၊ ပရိုတိန်းများနှင့် အနုစိပ်များရှိ HAP2/GCS1) 16,17,18,19။ပရိုတိန်းအများအပြားသည် gamete တွယ်တာမှုနှင့် ပေါင်းစပ်မှုအတွက် အရေးကြီးကြောင်းပြသခဲ့သော်လည်း လူသား gametes အတွက် Fusogens များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းမရှိသေးပေ။ကြွက်နှင့် လူသား gametes များပေါင်းစပ်မှုအတွက် လိုအပ်သော transmembrane ပရိုတင်း oocyte-expressed CD9 ကို 21,22,23 တွင်ပထမဆုံးရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။၎င်း၏တိကျသောလုပ်ဆောင်မှုမှာ မရှင်းလင်းသော်လည်း၊ တွယ်တာမှုတွင်ပါဝင်သည့်အခန်းကဏ္ဍ၊ ကြက်ဥ microvilli တွင် adhesion foci ၏ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် / သို့မဟုတ် oocyte မျက်နှာပြင်ပရိုတိန်းများ၏မှန်ကန်သောဒေသခံသည် 24,25,26 ဖြစ်ဖွယ်ရှိသည်။gamete ပေါင်းစပ်မှုအတွက် အရေးကြီးဆုံးသော ပုံမှန်ပရိုတိန်းနှစ်ခုမှာ သုက်ပိုးပရိုတင်း IZUMO127 နှင့် oocyte ပရိုတင်း JUNO28 ဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့ အပြန်အလှန်ပေါင်းသင်းမှုသည် ပေါင်းစပ်ခြင်းမပြုမီ gamete အသိအမှတ်ပြုမှုနှင့် တွယ်တာမှုတွင် အရေးကြီးသောအဆင့်ဖြစ်သည်။Izumo1 နောက်ကောက်ကြွက်အထီးနှင့် Juno နောက်ကောက်ကြွက်အမများသည် လုံးဝမြုံနေကြသည်၊ ဤမော်ဒယ်များတွင် သုက်ပိုးများသည် perivitelline နေရာကို ဝင်ရောက်သော်လည်း gametes များ ပေါင်းစပ်ခြင်းမရှိပါ။အလားတူ၊ လူ့ဗီထရိုမျိုးအောင်ခြင်းစမ်းသပ်မှုတွင် gametes ဆန့်ကျင်ဘက် IZUMO1 သို့မဟုတ် JUNO27,29 ပဋိပစ္စည်းများဖြင့် ကုသသောအခါ မြစ်ဆုံအား လျော့သွားသည်။
မကြာသေးမီက အသစ်တွေ့ရှိခဲ့သော သုက်ပိုး-ဖော်ပြသော ပရိုတိန်းအုပ်စုတစ်စုကို IZUMO1 နှင့် JUNO20,30,31,32,33,34,35 တို့ကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။သုက်ပိုး acrosomal အမြှေးပါး-ဆက်စပ်ပရိုတိန်း 6 (SPACA6) ကို ကြီးမားသော murine mutagenesis လေ့လာမှုတစ်ခုတွင် မျိုးအောင်ရန်အတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်ကြောင်း ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။Spaca6 ဗီဇထဲသို့ transgene ပေါင်းထည့်ခြင်းက သုတ်ပိုးမွှားများကို perivitelline space 36 သို့ စိမ့်ဝင်သွားစေသော်လည်း၊ သုတ်ပိုးမွှားများကို ထုတ်လုပ်ပေးပါသည်။ကြွက်များတွင် နောက်ကောက်ကျသည့် လေ့လာမှုများက Spaca6 ကို gamete fusion 30,32 အတွက် လိုအပ်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။SPACA6 ကို ဝှေးစေ့များတွင် သီးသန့်နီးပါး ဖော်ပြထားပြီး ခရိုဆိုမ့်တုံ့ပြန်မှု မတိုင်မီ သုတ်ကောင်၏ အတွင်းပိုင်းအတွင်း၌ ဖြစ်သော IZUMO1 နှင့် ဆင်တူသော ဒေသဆိုင်ရာ အသွင်ကူးပြောင်းမှု ပုံစံတစ်ခု ပါရှိသည်။Spaca6 homologues များသည် နို့တိုက်သတ္တဝါမျိုးစုံနှင့် အခြားသော eukaryotes 30 တွင်တည်ရှိပြီး SPACA6 30 ကိုခံနိုင်ရည်ရှိ၍ လူသား gamete ပေါင်းစပ်မှုအတွက်၎င်း၏အရေးပါမှုကိုပြသထားသည်။IZUMO1 နှင့် JUNO နှင့်မတူဘဲ SPACA6 ၏ဖွဲ့စည်းပုံ၊ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်များ၏အသေးစိတ်အချက်အလက်များမှာ မရှင်းလင်းပါ။
သားဆက်ခြားခြင်း နှင့် မျိုးပွားခြင်းကုသမှုတွင် အနာဂတ်တိုးတက်မှုများကို အသိပေးနိုင်စေမည့် လူသားသုက်ပိုးနှင့် မျိုးဥများပေါင်းစပ်ခြင်းဆိုင်ရာ အခြေခံလုပ်ငန်းစဉ်ကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာနားလည်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် SPACA6 တည်ဆောက်ပုံနှင့် ဇီဝဓာတုလေ့လာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။SPACA6 ၏ extracellular domain ၏ crystal structure သည် helical အစုအဝေးလေးခု (4HB) နှင့် immunoglobulin-like (Ig-like) domain တစ်ခုအား ပြသထားသည်။ယခင်လေ့လာမှုများတွင် ခန့်မှန်းထားသည့်အတိုင်း SPACA6 ၏ဒိုမိန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် 7,32,37 သည် လူ့ IZUMO1 နှင့်ဆင်တူပြီး ပရိုတင်းနှစ်ခုသည် ပုံမှန်မဟုတ်သောပုံစံတစ်ခုဖြစ်သည်- 4HB သည် တြိဂံပုံဂံမျက်နှာပြင်နှင့် disulfide-linked CXXC motifs တစ်စုံရှိသည်။ယခု IZUMO1 နှင့် SPACA6 သည် gamete fusion နှင့် ဆက်စပ်နေသော ပရိုတင်းများ၏ ကြီးမားပြီး ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံအရ ဆက်နွယ်နေသော superfamily ကို သတ်မှတ်ဖော်ပြရန် ကျွန်ုပ်တို့ အဆိုပြုပါသည်။superfamily ၏ထူးခြားသောအင်္ဂါရပ်များကိုအသုံးပြု၍ gamete fusion နှင့်/or fertilization တွင်ပါ၀င်သောအဖွဲ့ဝင်အများအပြားအပါအဝင်၊ ဤ superfamily ၏နောက်ထပ်အဖွဲ့ဝင်များကိုခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသော AlphaFold structural human proteome ကို အပြည့်အဝရှာဖွေခဲ့ပါသည်။gamete fusion နှင့် ဆက်နွယ်နေသော ပရိုတင်းများ ၏ ဘုံဖွဲ့စည်းပုံ ခေါက်နှင့် superfamily ရှိကြောင်း တွေ့ရှိရပြီး၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ တည်ဆောက်ပုံသည် လူ့ gamete fusion ယန္တရား၏ အရေးကြီးသော အသွင်အပြင်၏ မော်လီကျူးမြေပုံကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
SPACA6 သည် N-linked glycan တစ်ခုနှင့် putative disulfide bonds ခြောက်ခုပါရှိသော single-pass transmembrane ပရိုတင်းဖြစ်သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် Drosophila S2 ဆဲလ်များတွင် လူသား SPACA6 (အကြွင်းအကျန် 27-246) ၏ ပြင်ပဆဲလ်ဒိုမိန်းကို ဖော်ပြပြီး နီကယ်ဆက်နွယ်မှုရှိသော၊ cation လဲလှယ်ခြင်းနှင့် အရွယ်အစားဖယ်ထုတ်ထားသော ခရိုမာတိုဂရမ် (ပုံ။ S1b) ကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းကို သန့်စင်ခဲ့သည်။သန့်စင်ထားသော SPACA6 ectodomain သည် အလွန်တည်ငြိမ်ပြီး တစ်သားတည်းဖြစ်နေသည်။အရွယ်အစား ဖယ်ထုတ်ထားသော chromatography ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (SEC-MALS) နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော မော်လီကျူးအလေးချိန် 26.2 ± 0.5 kDa (ပုံ။ S1c) ဖြင့် အထွတ်အထိပ်တစ်ခုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။၎င်းသည် SPACA6 monomeric ectodomain အရွယ်အစားနှင့် ကိုက်ညီပြီး သန့်စင်မှုအတွင်း oligomerization မဖြစ်ပေါ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ထို့အပြင်၊ စက်ဝိုင်းရှိ dichroism (CD) spectroscopy သည် အရည်ပျော်မှတ် 51.3°C (ပုံ။ S1d၊ e) နှင့် ရောစပ်ထားသော α/β တည်ဆောက်ပုံကို ပြသခဲ့သည်။CD spectra ၏ ဖောက်ပြန်မှုသည် 38.6% α-helical နှင့် 15.8% β-သောင်တင်နေသော ဒြပ်စင်များ (ပုံ S1d) ကို ဖော်ထုတ်ပြသခဲ့သည်။
SPACA6 ectodomain သည် ကျပန်း matrix seeding38 ကို အသုံးပြု၍ ပုံဆောင်ခဲများဖြင့် ကြည်လင်ပြတ်သားပြီး 2.2 Å (ဇယား 1 နှင့် ပုံ S3) ရှိသော ဒေတာအစုံကို ရရှိခဲ့သည်။အပိုင်းအစ-အခြေခံမော်လီကျူးအစားထိုးခြင်းနှင့် SAD အဆင့်ဆင့်ဖွဲ့စည်းပုံဆုံးဖြတ်ခြင်းအတွက် bromide ထိတွေ့မှုနှင့်အတူ (ဇယား 1 နှင့် ပုံ S4) ကိုအသုံးပြု၍ နောက်ဆုံးသန့်စင်ထားသောပုံစံတွင် အကြွင်းအကျန် 27-246 ပါဝင်သည်။ဖွဲ့စည်းပုံကို ဆုံးဖြတ်ချိန်တွင်၊ စမ်းသပ်မှု သို့မဟုတ် AlphaFold တည်ဆောက်ပုံများ မရရှိနိုင်ပါ။SPACA6 ectodomain သည် 20 Å × 20 Å × 85 Å ၊ helices ခုနစ်ခုနှင့် β-strands ကိုးခုပါဝင်ပြီး disulfide bonds ခြောက်ခုဖြင့် တည်ငြိမ်သော ရှည်လျားသောအဆင့်မြင့်ခေါက်တစ်ခုပါရှိသည် (ပုံ။ 1a၊ b)။Asn243 ဘေးထွက်ကွင်းဆက်၏အဆုံးရှိ အားနည်းသော အီလက်ထရွန်သိပ်သည်းဆသည် ဤကျန်ကြွင်းသည် N-linked glycosylation တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံတွင် ဒိုမိန်းနှစ်ခုပါဝင်သည်- N-terminal four-helix အတွဲ (4HB) နှင့် ၎င်းတို့ကြားတွင် အလယ်အလတ်ပတ္တာဒေသတစ်ခုပါရှိသော C-terminal Ig-like domain တစ်ခု (ပုံ။ 1c)။
SPACA6 ၏ extracellular domain ၏ဖွဲ့စည်းပုံ။SPACA6 ၏ extracellular domain ၏ strip diagram၊ ကွင်းဆက်၏အရောင်သည် N မှ C-terminus နက်ပြာမှ အနီရောင်အထိဖြစ်သည်။disulfide bonds တွင်ပါဝင်သော cysteine ​​များကို ခရမ်းရောင်တွင် မီးမောင်းထိုးပြသည်။b SPACA6 ၏ extracellular domain ၏ topology။ပုံ 1a တွင် ပါရှိသည့် တူညီသော အရောင်အသွေးကို အသုံးပြုပါ။c SPACA6 extracellular ဒိုမိန်း။4HB၊ ပတ္တာနှင့် Ig-like domain strip charts များသည် လိမ္မော်ရောင်၊ အစိမ်းနှင့် အပြာရောင် အသီးသီးရှိသည်။အလွှာများကို အတိုင်းအတာအဖြစ် ဆွဲမထားပါ။
SPACA6 ၏ 4HB ဒိုမိန်းတွင် အဓိက helices လေးခု (helices 1–4) ပါဝင်ပြီး helical helix (ပုံ 2a)၊ မျဉ်းပြိုင်နှင့် အပြိုင် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ (ပုံ. 2b) ၏ ပုံစံဖြင့် စီစဉ်ထားသည်။အလှည့်ကျ helix သေးသေးလေး (helix 1′) ကို အစုအဝေးတွင် ထောင့်မှန်ချထားပြီး helices 1 နှင့် 2 ဖြင့် တြိဂံပုံသဏ္ဍာန်ရှိသည်။ ပုံ။ 2a)။
4HB N-terminal strip chart။b အထပ်လေးခုပါသော အတွဲတစ်ခု၏ ထိပ်မြင်ကွင်း၊ helix တစ်ခုစီသည် N-terminus တွင် နက်ပြာရောင်နှင့် C-terminus တွင် နက်မှောင်သောအနီရောင်ဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။c 4HB အတွက် အပေါ်မှအောက်သို့ ခရုပတ်ဘီးပုံစံ၊ အကြွင်းအကျန်တစ်ခုစီကို အမိုင်နိုအက်ဆစ်ကုဒ်ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသော စက်ဝိုင်းတစ်ခုအဖြစ် ပြထားသည်။ဘီး၏ထိပ်ရှိ အမိုင်နိုအက်ဆစ်လေးမျိုးကိုသာ ရေတွက်ထားသည်။ဝင်ရိုးစွန်းမဟုတ်သော အကြွင်းအကျန်များသည် အဝါရောင်ရှိပြီး၊ ဝင်ရိုးစွန်းမှ မထုတ်ထားသော အကြွင်းအကျန်များသည် အစိမ်းရင့်ရောင်၊ အပြုသဘောဆောင်သော အကြွင်းအကျန်များသည် အပြာရောင်ဖြစ်ပြီး၊ အနုတ်သဘောဆောင်သည့် အကြွင်းအကျန်များမှာ အနီရောင်ဖြစ်သည်။d 4HB ဒိုမိန်း၏ တြိဂံမျက်နှာများ၊ လိမ္မော်ရောင်ဖြင့် 4HBs နှင့် အစိမ်းရောင် ပတ္တာများinsets နှစ်ခုစလုံးသည် လှံပုံသဏ္ဍာန် disulfide နှောင်ကြိုးများကို ပြသသည်။
4HB ကို aliphatic နှင့် aromatic အကြွင်းအကျန်များ (ပုံ. 2c) ဖြင့် အဓိကဖွဲ့စည်းထားသည့် အတွင်း hydrophobic core ပေါ်တွင် စုစည်းထားသည်။အူတိုင်တွင် Cys41 နှင့် Cys55 ကြားရှိ disulfide နှောင်ကြိုးများ 1 နှင့် 2 ကို အပေါ်ပိုင်းရှိ တြိဂံတစ်ခုတွင် အတူတကွ ချိတ်ဆက်ပေးသည့် disulfide bond ပါရှိသည်။Helix 1′ ရှိ CXXC motif နှင့် ပတ္တာဒေသရှိ β-hairpin ၏ထိပ်တွင်တွေ့ရှိသော အခြား CXXC motif အကြားတွင် နောက်ထပ် disulfide ချည်နှောင်မှုနှစ်ခုကို ဖွဲ့စည်းခဲ့သည် (ပုံ။ 2d)။အမည်မသိလုပ်ဆောင်မှု (Arg37) ပါသော ရှေးရိုးစွဲ အာဂျင်နင်းအကြွင်းအကျန်သည် helices 1′၊ 1 နှင့် 2 တို့ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော အခေါင်းပေါက်တြိဂံအတွင်းတွင် တည်ရှိပါသည်။ Aliphatic ကာဗွန်အက်တမ် Cβ, Cγ, နှင့် Cδ Arg37 တို့သည် hydrophobic core နှင့် တုံ့ပြန်ကြပြီး ၎င်း၏ guanidine အုပ်စုများသည် စက်ဘီးစီးစွာ ရွေ့လျားကြသည်။ helices 1′ နှင့် 1 အကြား Thr32 ကျောရိုးနှင့် ဘေးကွင်းဆက် (ပုံ။ S5a၊ b) အကြား အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများမှတဆင့်။Tyr34 သည် Arg37 နှင့် ဓါတ်ပြုနိုင်သည့် သေးငယ်သော အပေါက်နှစ်ခုကို ချန်ထားသော အပေါက်ထဲသို့ ချဲ့သည်။
Ig-like β-sandwich domains များသည် hydrophobic core 39 မှတဆင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်သော နှစ်ခု သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပိုသော ကြိုးမဲ့ amphipathic β-sheets များ၏ ဘုံအင်္ဂါရပ်ကို မျှဝေသည့် ပရိုတင်းများ၏ ကြီးမားသောစူပါမိသားစုတစ်စုဖြစ်သည်။ အလွှာနှစ်ခုပါ၀င်သည် (ပုံ။ S6a)။Sheet 1 သည် မျဉ်းတန်းလေးခု (D၊ F၊ H၊ နှင့် I) ၏ β-စာရွက်တစ်ခုဖြစ်ပြီး strands F၊ H နှင့် ငါသည် အပြိုင်ဆန့်ကျင်သော အစီအစဉ်ဖြစ်ပြီး I နှင့် D တို့သည် အပြိုင်အပြန်အလှန်လုပ်ဆောင်သည့် ကြိုးတန်းလေးခုဖြစ်သည်။ဇယား 2 သည် အပြိုင်ဆန့်ထုတ်သော နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော ဘီတာစာရွက်ငယ် (ကြိုးတန်း E နှင့် G) ဖြစ်သည်။E ကွင်းဆက်၏ C-terminus နှင့် H ကွင်းဆက် (Cys170-Cys226) (ပုံ။ S6b) အကြား အတွင်းပိုင်း disulfide နှောင်ကြိုးကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤ disulfide bond သည် immunoglobulin40,41 ၏ β-sandwich domain ရှိ disulfide bond နှင့် ဆင်တူသည်။
ကြိုးလေးခုပါ ဘီတာစာရွက်သည် ၎င်း၏ အရှည်တစ်လျှောက်လုံး လှည့်ပတ်ကာ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် အီလက်ထရွန်းနစ်များ ကွဲပြားသည့် အချိုးမညီသော အစွန်းများ ဖြစ်ပေါ်လာသည်။ပိုမိုပါးလွှာသော အစွန်းသည် SPACA6 (ပုံ။ S6b,c) ရှိ ကျန်မညီညာသော၊ လျှပ်စစ်ဓာတ်နည်းသော ကွဲပြားသော မျက်နှာပြင်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ထင်ရှားပေါ်လွင်သော ပြန့်ပြူးသော ပတ်ဝန်းကျင် မျက်နှာပြင်ဖြစ်သည်။ထိတွေ့နေသော ကျောရိုးကာဗွန်နိုင်း/အမိုင်နိုအုပ်စုများနှင့် ဝင်ရိုးစွန်းအခြမ်းကြိုးများသည် ရေအားလျှပ်စစ်မျက်နှာပြင် (ပုံ။ S6c) ဝန်းရံထားသည်။ကျယ်ပြန့်သောအနားသတ်သည် ဟိုက်ဒရိုဖိုဘစ်အူတိုင်၏ N-terminal အပိုင်းကို ပိတ်ဆို့ထားပြီး F ကွင်းဆက်ကျောရိုး၏ ဖွင့်ဝင်ရိုးစွန်းအုပ်စုနှင့် ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးသုံးချောင်းကို ဖွဲ့စည်းထားသည်။ဤအစွန်း၏ C-terminal အပိုင်းသည် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းထိတွေ့ထားသော hydrophobic core ပါသော အိတ်ကပ်ကြီးတစ်ခုဖြစ်သည်။နှစ်ဆ အာဂျင်နင်း အကြွင်းအကျန်သုံးစုံ (Arg162-Arg221၊ Arg201-Arg205 နှင့် Arg212-Arg214) နှင့် Central histidine (His220) (ပုံ S6e) တို့ကြောင့် အိတ်ကပ်ကို အပြုသဘောဆောင်သော စွဲချက်များဖြင့် ဝန်းရံထားသည်။
ပတ္တာဧရိယာသည် helical domain နှင့် Ig-like domain အကြားရှိ အပိုင်းတိုတစ်ခုဖြစ်ပြီး၊ အပြိုင်ဆန့်ကျင်ဘက်သုံးကြိုးမျှင် beta-layer (strands A၊ B နှင့် C)၊ သေးငယ်သော 310 helix နှင့် ရှည်လျားသောကျပန်း helical အပိုင်းများစွာ ပါဝင်ပါသည်။(ပုံ။ S7)။ပတ္တာဒေသရှိ covalent နှင့် electrostatic အဆက်အသွယ်များ၏ ကွန်ရက်တစ်ခုသည် 4HB နှင့် Ig-like domain အကြား တိမ်းညွှတ်မှုကို တည်ငြိမ်စေပုံပေါ်သည်။ကွန်ရက်ကို သုံးပိုင်းခွဲနိုင်သည်။ပထမအပိုင်းတွင် ပတ္တာရှိ β-hairpin နှင့် 4HB ရှိ 1′ helix အကြား disulfide ချည်နှောင်မှုတစ်ခုအဖြစ် CXXC motif နှစ်ခု (27CXXC30 နှင့် 139CXXC142) ပါဝင်သည်။ဒုတိယအပိုင်းတွင် Ig-like domain နှင့် hinge အကြား electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ ပါဝင်သည်။ပတ္တာအတွင်းရှိ Glu132 သည် Ig-like domain တွင် Arg233 နှင့် ပတ္တာအတွင်းရှိ Arg135 ဖြင့် ဆားတံတားကိုဖွဲ့စည်းသည်။တတိယအပိုင်းတွင် Ig-like domain နှင့် hinge region အကြား covalent bond တစ်ခု ပါဝင်သည်။disulfide bonds နှစ်ခု (Cys124-Cys147 နှင့် Cys128-Cys153) သည် Gln131 နှင့် backbone functional group အကြား electrostatic အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများဖြင့် တည်ငြိမ်သော linker တစ်ခုနှင့် hinge loop ကို ချိတ်ဆက်ပေးကာ ပထမ Ig-like domain သို့ ဝင်ရောက်နိုင်သည်။ကွင်းဆက်။
SPACA6 ectodomain ၏ ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် 4HB နှင့် Ig-like domains များ၏ တစ်ဦးချင်းဖွဲ့စည်းပုံများကို ပရိုတင်းဒေတာဘေ့စ်များတွင် တည်ဆောက်ပုံသဏ္ဍန်တူသော မှတ်တမ်းများကို ရှာဖွေရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။မြင့်မားသော Dali Z ရမှတ်များ၊ သေးငယ်သော စံသွေဖည်မှုများနှင့် LALI ရမှတ်ကြီးများ (နောက်တစ်ခုသည် ဖွဲ့စည်းပုံနှင့်ညီမျှသော အကြွင်းအကျန်များ) နှင့် ကိုက်ညီမှုများကို ဖော်ထုတ်ထားပါသည်။အပြည့်အ၀ ectodomain ရှာဖွေမှု (Table S1) မှ ပထမဆုံး hits 10 ခုတွင် လက်ခံနိုင်သော Z-score သည် >842 ရှိသော်လည်း 4HB သို့မဟုတ် Ig-like domain တစ်ခုတည်းအတွက် ရှာဖွေမှုတွင် အဆိုပါ hit အများစုသည် β-sandwiches များနှင့်သာ သက်ဆိုင်ကြောင်းပြသခဲ့သည်။ပရိုတင်းအများအပြားတွင် နေရာအနှံ့အပြားတွေ့ရှိရသည်။Dali ရှိ ရှာဖွေမှု သုံးခုစလုံးသည် ရလဒ်တစ်ခုသာ ဖြစ်သည်- IZUMO1။
SPACA6 နှင့် IZUMO1 သည် တည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီမှုများ 7,32,37 ကို မျှဝေရန် အကြံပြုထားသည်မှာ ကြာပါပြီ။ဤ gamete ပေါင်းစပ်-ဆက်စပ်ပရိုတိန်းနှစ်ခု၏ ectodomains များသည် 21% sequence identity (Figure S8a) တွင်သာ မျှဝေသော်လည်း၊ ထိန်းသိမ်းထားသော disulfide နှောင်ကြိုးပုံစံနှင့် SPACA6 ရှိ ခန့်မှန်းထားသော C-terminal Ig-like domain တစ်ခုအပါအဝင် ရှုပ်ထွေးသောအထောက်အထားများဖြင့် တည်ဆောက်ရန် အစောပိုင်းကြိုးပမ်းမှုများကို ခွင့်ပြုထားသည်။ စံပလိတ် ၃၇ အဖြစ် IZUMO1 ကို အသုံးပြု၍ SPACA6 မောက်စ် A ၏ တူညီသောပုံစံကျွန်ုပ်တို့၏ဖွဲ့စည်းပုံသည် ဤခန့်မှန်းချက်များကို အတည်ပြုပြီး စစ်မှန်သောတူညီမှုအတိုင်းအတာကိုပြသသည်။တကယ်တော့၊ SPACA6 နှင့် IZUMO137,43,44 တည်ဆောက်ပုံများသည် တူညီသော ဒိုမိန်းနှစ်ခုဗိသုကာ (ပုံ။ S8b) တွင် အလားတူ 4HB နှင့် Ig-like β-sandwich domains များကို ပတ္တာဧရိယာ (ပုံ။ S8c) ဖြင့် မျှဝေပါသည်။
IZUMO1 နှင့် SPACA6 4HB သည် သမားရိုးကျ ခရုပတ်အစုအဝေးများနှင့် ဘုံကွဲလွဲမှုများရှိသည်။ပုံမှန် 4HB များသည် endosomal fusion 45,46 တွင်ပါ၀င်သော SNARE ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးမှုများကဲ့သို့ပင်၊ ဗဟိုဝင်ရိုး 47 ပတ်လည်တွင် အဆက်မပြတ်ကွေးညွှတ်မှုကို ထိန်းသိမ်းထားသည့် အညီအမျှနေရာယူထားသည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ IZUMO1 နှင့် SPACA6 နှစ်ခုစလုံးရှိ helical domains များသည် ပုံပျက်နေပြီး ပြောင်းလဲနိုင်သော ကွေးညွှတ်မှုနှင့်၊ မညီမညာသော ထုပ်ပိုးမှု (ပုံ S8d)။helices 1′၊ 1 နှင့် 2 တို့ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော တြိဂံကြောင့်ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော လှည့်ကွက်ကို IZUMO1 နှင့် SPACA6 တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး helix 1′ ရှိ တူညီသော CXXC motif ဖြင့် တည်ငြိမ်သည်။သို့သော်၊ SPACA6 တွင်တွေ့ရှိရသော ထပ်လောင်း disulfide နှောင်ကြိုး (Cys41 နှင့် Cys55 သည် အထက်တွင်ရှိသော helices 1 နှင့် 2 ကို ချိတ်ဆက်ထားသည်) သည် တြိဂံအထွတ်တွင် ပိုမိုပြတ်သားသော အထွတ်ကို ဖန်တီးပေးကာ SPACA6 သည် IZUMO1 ထက် ပိုလိမ်သွားကာ ပိုမိုသိသာထင်ရှားသော အပေါက်များရှိသော တြိဂံဖြစ်သည်။ထို့အပြင်၊ IZUMO1 သည် SPACA6 ရှိ ဤအပေါက်၏အလယ်ဗဟိုတွင်တွေ့ရှိရသော Arg37 ချို့တဲ့သည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ IZUMO1 တွင် aliphatic နှင့် aromatic အကြွင်းအကျန်များ၏ ပုံမှန် hydrophobic core တစ်ခုရှိသည်။
IZUMO1 တွင် နှစ်ထပ်သောင်တင်ကာ β-sheet43 ပါ၀င်သော Ig-like domain တစ်ခုရှိသည်။IZUMO1 တွင် အပိုကြိုးမျှင်သည် SPACA6 ရှိ ကွိုင်ကို အစားထိုးပြီး ကြိုးမျှင်ရှိ ကျောရိုးရှိ ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို ကန့်သတ်ရန် F ကြိုးမျှင်နှင့် တုံ့ပြန်သည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသော နှိုင်းယှဉ်ချက်မှာ ပရိုတင်းနှစ်ခု၏ Ig-like domains များ၏ မျက်နှာပြင်တာဝန်ခံဖြစ်သည်။IZUMO1 မျက်နှာပြင်သည် SPACA6 မျက်နှာပြင်ထက် အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သော အားပိုပါသည်။ထပ်လောင်းအားသွင်းမှုတစ်ခုသည် သုတ်ပိုးအမြှေးပါးကို မျက်နှာမူထားသော C-terminus အနီးတွင် တည်ရှိသည်။SPACA6 တွင်၊ တူညီသောဒေသများသည် ဘက်မလိုက်သော သို့မဟုတ် အပြုသဘောဖြင့် ကောက်ခံသည် (ပုံ။ S8e)။ဥပမာအားဖြင့်၊ SPACA6 ရှိ ရေအားလျှပ်စစ်မျက်နှာပြင် (ပါးလွှာသောအစွန်းများ) နှင့် SPACA6 ရှိ အပြုသဘောဆောင်သော တွင်းများ (ပိုကျယ်သော အနားသတ်များ) ကို IZUMO1 တွင် အနုတ်လက္ခဏာပြထားပါသည်။
IZUMO1 နှင့် SPACA6 ကြားရှိ ဆက်နွယ်မှုနှင့် အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဒြပ်စင်များကို ကောင်းစွာထိန်းသိမ်းထားသော်လည်း Ig-like domains များ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ချိန်ညှိမှုသည် ဒိုမိန်းနှစ်ခုသည် တစ်ခုနှင့်တစ်ခုဆက်စပ်နေသော ယေဘုယျဦးတည်ချက်တွင် ကွဲပြားကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ။ S9)။IZUMO1 ၏ ခရုပတ်အစုအဝေးသည် β-sandwich နှင့်ပတ်သက်ပြီး ကွေးကောက်ကာ ဗဟိုဝင်ရိုးမှ 50° ခန့်တွင် ယခင်ကဖော်ပြထားသော “boomerang” ပုံသဏ္ဍာန်ကို ဖန်တီးထားသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ SPACA6 ရှိ helical beam သည် ဆန့်ကျင်ဘက်သို့ 10° ခန့် စောင်းနေပါသည်။အဆိုပါ လမ်းကြောင်းများတွင် ကွဲပြားမှုများသည် ပတ္တာဒေသရှိ ကွဲပြားမှုများကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။မူလတန်းစီအဆင့်တွင်၊ IZUMO1 နှင့် SPACA6 သည် cysteine၊ glycine နှင့် aspartic acid အကြွင်းအကျန်များမှ လွဲ၍ ပတ္တာတွင် အနည်းငယ်သော အတွဲဆင်တူမှုရှိသည်။ရလဒ်အနေဖြင့်၊ ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများနှင့် electrostatic ကွန်ရက်များသည် လုံးဝကွဲပြားသည်။IZUMO1 ရှိ ကွင်းဆက်များသည် များစွာရှည်လျားပြီး 310 helix (helix 5) သည် SPACA6 အတွက် ထူးခြားသော်လည်း၊ဤကွာခြားချက်များသည် အခြားအခြားသော အလားတူပရိုတိန်းနှစ်ခုအတွက် မတူညီသော ဒိုမိန်းလမ်းကြောင်းများကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ Dali ဆာဗာရှာဖွေမှုတွင် SPACA6 နှင့် IZUMO1 သည် ဤအထူးသဖြင့် 4HB ခေါက် (Table S1) ပါရှိသည့် ပရိုတင်းဒေတာဘေ့စ်တွင် သိမ်းဆည်းထားသည့် တစ်ခုတည်းသော စမ်းသပ်သတ်မှတ်ထားသော တည်ဆောက်ပုံနှစ်ခုသာဖြစ်ကြောင်း ဖော်ပြခဲ့သည်။မကြာသေးမီက၊ DeepMind (Alphabet/Google) သည် မူလတန်းဆက် ၄၈ မှ ပရိုတိန်းများ၏ 3D ဖွဲ့စည်းပုံများကို တိကျစွာခန့်မှန်းနိုင်သော အာရုံကြောကွန်ရက်အခြေပြုစနစ် AlphaFold ကို တီထွင်ခဲ့သည်။SPACA6 ဖွဲ့စည်းပုံကို ကျွန်ုပ်တို့ဖြေရှင်းပြီးနောက် မကြာမီတွင်၊ AlphaFold ဒေတာဘေ့စ်သည် လူ့ပရိုတိန်း 48,49 အတွင်းရှိ ပရိုတိန်းအားလုံး၏ 98.5% ကို လွှမ်းခြုံထားသော ခန့်မှန်းဖွဲ့စည်းပုံပုံစံများကို ပေးဆောင်သည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ဖြေရှင်းထားသော SPACA6 ဖွဲ့စည်းပုံကို ရှာဖွေမှုပုံစံတစ်ခုအနေဖြင့် အသုံးပြု၍ AlphaFold လူသား proteome ရှိ မော်ဒယ်အတွက် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီမှုကို ရှာဖွေခြင်းသည် SPACA6 နှင့် IZUMO1 တို့နှင့် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီသည့် ကိုယ်စားလှယ်လောင်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ပေးပါသည်။SPACA6 (ပုံ. S10a) ကို ဟောကိန်းထုတ်ရာတွင် AlphaFold ၏ မယုံနိုင်လောက်အောင် တိကျမှုဖြင့်—အထူးသဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့ဖြေရှင်းထားသော ဖွဲ့စည်းပုံ (ပုံ. S10b) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 1.1 Å rms ectodomain သည်—ဖော်ထုတ်ထားသော SPACA6 ကိုက်ညီမှုများသည် တိကျဖွယ်ရှိသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယုံကြည်နိုင်ပါသည်။
ယခင်က၊ PSI-BLAST သည် အခြားသော သုက်ပိုးဆိုင်ရာ ပရိုတင်း ၃ မျိုးဖြင့် IZUMO2၊ IZUMO3 နှင့် IZUMO450 တို့နှင့်အတူ IZUMO1 အစုအဝေးကို ရှာဖွေခဲ့သည်။ဤ IZUMO မိသားစုပရိုတိန်းများသည် IZUMO1 (ပုံ 3a နှင့် S11) ကဲ့သို့တူညီသော disulfide နှောင်ကြိုးပုံစံဖြင့် 4HB ဒိုမိန်းသို့ ခေါက်သွားသည်ဟု AlphaFold က ခန့်မှန်းထားသည်။IZUMO2 နှင့် IZUMO3 သည် IZUMO1 နှင့်ဆင်တူသော တစ်ဖက်သတ်အမြှေးပါးပရိုတင်းများဖြစ်ပြီး IZUMO4 လျှို့ဝှက်ထားပုံပေါ်သည်။gamete ပေါင်းစပ်မှုတွင် IZUMO 2၊ 3၊ နှင့် 4 ပရိုတင်းများ၏လုပ်ဆောင်ချက်များကို မဆုံးဖြတ်ရသေးပါ။IZUMO3 သည် သုက်ပိုးဖွံ့ဖြိုးမှု 51 ကာလအတွင်း acrosome biogenesis တွင်အခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်သည်ဟုလူသိများပြီး IZUMO ပရိုတင်းသည်ရှုပ်ထွေးသော 50 ကိုဖွဲ့စည်းရန်တွေ့ရှိခဲ့သည်။နို့တိုက်သတ္တဝါများ၊ တွားသွားသတ္တဝါများနှင့် ကုန်းနေရေနေသတ္တဝါများရှိ IZUMO ပရိုတင်းများကို ထိန်းသိမ်းခြင်းသည် ၎င်းတို့၏ အလားအလာရှိသောလုပ်ဆောင်ချက်သည် DCST1/2၊ SOF1 နှင့် FIMP ကဲ့သို့သော အခြားလူသိများသော gamete-fusion-ဆက်စပ်ပရိုတိန်းများနှင့် ကိုက်ညီကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
4HB၊ ပတ္တာနှင့် Ig-like ဒိုမိန်းများကို လိမ္မော်ရောင်၊ အစိမ်းရောင်နှင့် အပြာရောင်တို့ဖြင့် အသီးသီး မီးမောင်းထိုးပြထားသည့် IST superfamily ၏ ဒိုမိန်းဗိသုကာပုံ။IZUMO4 တွင် အမည်းရောင်ရှိသော ထူးခြားသော C-terminal ဒေသရှိသည်။အတည်ပြုထားသော နှင့် putative disulfide နှောင်ကြိုးများကို အစိုင်အခဲနှင့် အစက်ချမျဉ်းများဖြင့် အသီးသီးပြသထားသည်။b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLTM8-F95Al), နှင့် DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) သည် panel A ကဲ့သို့ တူညီသောအရောင်အကွာအဝေးတွင်ပြသထားသည်။ Disulfide bonds များကို ခရမ်းရောင်ဖြင့်ပြသထားသည်။TMEM95၊ IZUMO2 နှင့် IZUMO3 transmembrane helices များကို မပြပါ။
IZUMO ပရိုတင်းနှင့်မတူဘဲ၊ အခြား SPACA ပရိုတင်းများ (ဆိုလိုသည်မှာ SPACA1၊ SPACA3၊ SPACA4၊ SPACA5 နှင့် SPACA9) သည် SPACA6 (ပုံ။ S12) နှင့် ကွဲပြားသည်ဟု ယူဆပါသည်။SPACA9 တွင်သာ 4HB ရှိသည်၊ သို့သော် ၎င်းတွင် တူညီသောအပြိုင်-ဆန့်ကျင်-အပြိုင် တိမ်းညွှတ်မှု သို့မဟုတ် SPACA6 ကဲ့သို့တူညီသော disulfide နှောင်ကြိုးရှိရန် မမျှော်လင့်ပါ။SPACA1 တွင်သာ အလားတူ Ig-like domain တစ်ခုရှိသည်။AlphaFold သည် SPACA3၊ SPACA4 နှင့် SPACA5 တွင် SPACA6 နှင့် လုံးဝကွဲပြားသောဖွဲ့စည်းပုံရှိသည်ဟု ခန့်မှန်းသည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ SPACA4 သည် မျိုးအောင်ခြင်းတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှပါဝင်သည်ဟုလည်းသိရပြီး၊ သို့သော် သုက်ပိုးနှင့် oocyte zona pellucida52 အကြားအပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေမည့်အစား SPACA6 ထက် သာလွန်သောအတိုင်းအတာအထိဖြစ်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ AlphaFold ရှာဖွေမှုသည် IZUMO1 နှင့် SPACA6 4HB၊ TMEM95 အတွက် နောက်ထပ်ကိုက်ညီမှုတစ်ခုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။TMEM95၊ တစ်ခုတည်းသော သုက်ပိုးသတ်သတ်မှတ်မှတ် transmembrane ပရိုတိန်းသည် 32,33 လျော့သွားသောအခါတွင် အထီးကြွက်များကို မျိုးမပွားနိုင်စေရန် လုပ်ဆောင်ပေးသည်။TMEM95 ချို့တဲ့သော သုက်ပိုးများသည် ပုံမှန်ပုံစံရုပ်ပုံသဏ္ဍာန်၊ ရွေ့လျားမှုနှင့် zona pellucida ကို ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်နိုင်ပြီး မျိုးဥအမြှေးပါးနှင့် ချည်နှောင်နိုင်စွမ်းရှိသော်လည်း oocyte အမြှေးပါးနှင့် ပေါင်းစပ်၍မရပါ။ယခင်လေ့လာမှုများက TMEM95 သည် IZUMO133 နှင့်ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဆင်တူမှုများကိုမျှဝေထားကြောင်းပြသခဲ့သည်။အမှန်မှာ၊ AlphaFold မော်ဒယ်သည် TMEM95 သည် IZUMO1 နှင့် SPACA6 ကဲ့သို့ CXXC motifs နှင့် တူညီသော CXXC အတွဲနှင့် SPACA6 တွင်တွေ့ရသော helices 1 နှင့် 2 ကြားရှိ ထပ်လောင်း disulfide နှောင်ကြိုးများ (ပုံ. 3a နှင့် S11) တို့ကြားရှိ တူညီသောထပ်ဆောင်း disulfide နှောင်ကြိုးဖြစ်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။TMEM95 တွင် Ig-like ဒိုမိန်းမရှိသော်လည်း၊ ၎င်းတွင် SPACA6 နှင့် IZUMO1 ပတ္တာဒေသများ (ပုံ. 3b) နှင့် ဆင်တူသည့် disulfide နှောင်ကြိုးပုံစံရှိသည့် ဒေသတစ်ခုရှိသည်။ဤစာမူကို ထုတ်ဝေချိန်တွင်၊ ကြိုတင်ပရင့်ဆာဗာသည် AlphaFold53 ရလဒ်ကို အတည်ပြုပြီး TMEM95 ၏ ဖွဲ့စည်းပုံကို အစီရင်ခံခဲ့သည်။TMEM95 သည် SPACA6 နှင့် IZUMO1 နှင့် အလွန်ဆင်တူပြီး ကုန်းနေရေနေသတ္တဝါများတွင် ဆင့်ကဲထိန်းသိမ်းထားပြီးဖြစ်သည် (ပုံ 4 နှင့် S13)။
PSI-BLAST ရှာဖွေမှုသည် သက်ရှိပင်တိုင်၏ အနေအထားကို ဆုံးဖြတ်ရန် NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, DCST2, FIMP နှင့် SOF1 ဒေတာဘေ့စ်များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။အကိုင်းအခက်အမှတ်များကြား အကွာအဝေးကို အတိုင်းအတာအဖြစ် မပြပါ။
SPACA6 နှင့် IZUMO1 အကြား ထင်ရှားသော အလုံးစုံဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီမှုသည် TMEM95 နှင့် IZUMO 2၊ 3 နှင့် 4 ပရိုတိန်းများပါ၀င်သော ထိန်းသိမ်းထားသောဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ superfamily ၏အဖွဲ့ဝင်များကို တည်ထောင်ထားကြောင်း အကြံပြုထားသည်။လူသိများသောအဖွဲ့ဝင်များ- IZUMO1၊ SPACA6 နှင့် TMEM95။အဖွဲ့ဝင်အနည်းငယ်ကသာ Ig-like domains များပိုင်ဆိုင်ထားသောကြောင့် IST superfamily ၏ထူးခြားချက်မှာ 4HB ဒိုမိန်းဖြစ်ပြီး၊ ဤပရိုတိန်းများအားလုံးတွင်သာတူညီသောထူးခြားသောအင်္ဂါရပ်များပါရှိသည်- 1) Coiled 4HB နှင့်ဆန့်ကျင်ဖက်အပြိုင်/အပြိုင်အလှည့်အပြောင်းဖြင့်စီစဉ်ထားသော helices များ (ပုံ . 5a) ၊ 2) အစုအဝေးတွင် အစုအဝေးအတွင်း အဖုအထစ်နှစ်ခုနှင့် တတိယမြောက်ဒေါင်လိုက် helix (ပုံ။ သော့ဧရိယာ (ပုံ. 5c)) ပါဝင်သော တြိဂံပုံမျက်နှာတစ်ခုပါရှိသည်၊ redox အာရုံခံကိရိယာ 54,55,56 အဖြစ် IST မိသားစုဝင်များတွင် motif သည် gamete fusion ရှိ ERp57 ကဲ့သို့သော ပရိုတင်း disulfide isomerases နှင့် ဆက်စပ်နိုင်ပါသည်။ အခန်းကဏ္ဍများသည် 57,58 နှင့် ဆက်စပ်နေသည်။
IST superfamily ၏အဖွဲ့ဝင်များကို 4HB ဒိုမိန်း၏ အင်္ဂါရပ်သုံးရပ်ဖြင့် သတ်မှတ်သည်- အပြိုင်နှင့် ဆန့်ကျင်ဘက် တိမ်းညွှတ်မှုအကြား ရောနှောနေသော အထပ်လေးခု၊ ba-triangular helical အတွဲမျက်နှာများနှင့် သေးငယ်သောမော်လီကျူးများကြားတွင် ဖွဲ့စည်းထားသော ca CXXC နှစ်ထပ် motif တစ်ခု။) N-terminal helixes (လိမ္မော်ရောင်) နှင့် ပတ္တာဒေသ β-hairpin (အစိမ်းရောင်)။
SPACA6 နှင့် IZUMO1 အကြား တူညီမှုအရ၊ ယခင် IZUMO1 သို့မဟုတ် JUNO နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်သည့်စွမ်းရည်ကို စမ်းသပ်ခဲ့သည်။Biolayer interferometry (BLI) သည် IZUMO1 နှင့် JUNO အကြား အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို တွက်ချက်ရန်အတွက် ယခင်က အသုံးပြုခဲ့သော အရွေ့အခြေခံ ပေါင်းစပ်နည်းဖြစ်သည်။JUNO ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ မြင့်မားသော အာရုံစူးစိုက်မှုရှိသော ငါးစာအဖြစ် IZUMO1 ဖြင့် ဘိုင်အိုတင်-တံဆိပ်တပ်ထားသော အာရုံခံကိရိယာကို ပေါက်ဖွားပြီးနောက်၊ အာရုံခံကိရိယာထိပ်ဖျားနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ဇီဝရုပ်ထု၏အထူတွင် ချည်နှောင်မှုဖြစ်စေသော အပြောင်းအလဲကို ညွှန်ပြသည့် ခိုင်ခံ့သောအချက်ပြမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။အလားတူအချက်ပြမှုများ (ဆိုလိုသည်မှာ၊ JUNO သည် IZUMO1 ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ဆန့်ကျင်သည့် ငါးစာအဖြစ် အာရုံခံကိရိယာနှင့် တွဲထားသည်) (ပုံ။ S14b)။SPACA6 ကို အာရုံခံ-ဘောင်းထားသော IZUMO1 သို့မဟုတ် အာရုံခံ-ဘောင်ရှိ JUNO (ပုံ S14a၊ b) နှင့် ပတ်သက်သည့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအဖြစ် SPACA6 ကို အသုံးပြုသောအခါ မည်သည့်အချက်ကိုမျှ ရှာမတွေ့ပါ။ဤအချက်ပြမှု မရှိခြင်းသည် SPACA6 ၏ extracellular domain သည် IZUMO1 သို့မဟုတ် JUNO ၏ extracellular domain နှင့် အကျိုးသက်ရောက်မှုမရှိသည်ကို ညွှန်ပြပါသည်။
BLI assay သည် bait protein ပေါ်ရှိ free lysine အကြွင်းအကျန်များ၏ biotinylation ကို အခြေခံထားသောကြောင့်၊ ဤပြုပြင်မှုသည် lysine အကြွင်းအကျန်များ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုတွင် ပါဝင်ပါက binding ကို တားဆီးနိုင်သည်။ထို့အပြင်၊ အာရုံခံကိရိယာနှင့် ဆက်စပ်သော ချိတ်ဆက်မှု၏ တိမ်းညွှတ်မှုသည် steric အတားအဆီးများကို ဖန်တီးနိုင်သည်၊ ထို့ကြောင့် သမားရိုးကျ ဆွဲချစမ်းသပ်မှုများကို ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော SPACA6၊ IZUMO1 နှင့် JUNO ectodomains များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဤအရာဖြစ်လင့်ကစား၊ SPACA6 သည် BLI စမ်းသပ်မှုများတွင် တွေ့ရှိထားသည့်အရာများနှင့် ကိုက်ညီမှုမရှိသော တုံ့ပြန်မှုမရှိကြောင်း ဖော်ပြထားသောကြောင့် သူ၏ tagged IZUMO1 သို့မဟုတ် His-tagged JUNO (ပုံ။အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ၎င်း၏ IZUMO1 (ပုံ S14e နှင့် S15) တံဆိပ်တပ်ထားသော JUNO ၏ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို အတည်ပြုခဲ့သည်။
SPACA6 နှင့် IZUMO1 အကြား တည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီနေသော်လည်း SPACA6 ၏ JUNO ကို ချည်နှောင်နိုင်ခြင်းမှာ အံ့သြစရာမဟုတ်ပေ။လူ့ IZUMO1 ၏မျက်နှာပြင်တွင် JUNO နှင့် ဓါတ်ပြုနိုင်သည့် အကြွင်းအကျန် 20 ကျော်ရှိပြီး ဒေသသုံးခုမှ အကြွင်းအကျန်များ (အများစုမှာ ပတ္တာဒေသတွင်ရှိသော်လည်း) (ပုံ။ S14f)။ဤအကြွင်းအကျန်များထဲမှ တစ်ခုကို SPACA6 (Glu70) တွင် ထိန်းသိမ်းထားပါသည်။အကြွင်းအကျန်အများအပြားကို အစားထိုးခြင်းများသည် ၎င်းတို့၏မူလဇီဝဓာတုဂုဏ်သတ္တိများကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားသော်လည်း၊ IZUMO1 ရှိ မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော Arg160 အကြွင်းအကျန်ကို SPACA6 ရှိ Asp148 ဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ယခင်လေ့လာမှုများက IZUMO1 ရှိ Arg160Glu ဗီဇပြောင်းလဲမှုသည် JUNO43 နှင့် ချိတ်ဆက်မှုကို လုံးဝနီးပါးဖျက်သိမ်းကြောင်းပြသခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ IZUMO1 နှင့် SPACA6 အကြား ဒိုမိန်း တိမ်းညွှတ်မှု ကွာခြားချက်သည် SPACA6 (ပုံ။ S14g) ရှိ ညီမျှသော ဒေသ၏ JUNO-binding site ၏ မျက်နှာပြင် ဧရိယာကို သိသိသာသာ တိုးလာစေပါသည်။
gamete ပေါင်းစပ်မှုအတွက် SPACA6 အတွက် လူသိများပြီး IZUMO1 နှင့် တူညီသော်လည်း၊ SPACA6 တွင် ညီမျှသော JUNO binding function ပါ၀င်ပုံမပေါ်ပါ။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ် ဇီဝဗေဒမှ ပံ့ပိုးပေးသော အရေးကြီးသော အထောက်အထားများနှင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ တည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ အချက်အလက်များကို ပေါင်းစပ်ရန် ကြိုးပမ်းခဲ့သည်။SPACA6 homologues များ၏ တစ်ဆက်တည်း ချိန်ညှိမှုသည် နို့တိုက်သတ္တဝါများထက် ဘုံဖွဲ့စည်းပုံ၏ ထိန်းသိမ်းမှုကို ပြသသည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ cysteine ​​​​အကြွင်းအကျန်များသည် အဝေးမှဆက်စပ်နေသော ကုန်းနေရေနေသတ္တဝါများတွင်ပင် ရှိနေသည် (ပုံ။ 6a)။ConSurf ဆာဗာကို အသုံးပြု၍ ဆက်တိုက် ချိန်ညှိမှု သိမ်းဆည်းခြင်းဒေတာ အများအပြားကို SPACA6 မျက်နှာပြင်တွင် ပုံဖော်ထားသည်။ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအမျိုးအစားသည် ပရိုတိန်းဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်အတွင်း မည်သည့်အကြွင်းအကျန်များကို ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း ပြသနိုင်ပြီး မည်သည့်မျက်နှာပြင်ဒေသများ၏ လုပ်ဆောင်မှုတွင် ပါဝင်သည်ကို ညွှန်ပြနိုင်သည်။
CLUSTAL OMEGA ကို အသုံးပြု၍ ပြင်ဆင်ထားသော မတူညီသောမျိုးစိတ် 12 ခုမှ SPACA6 ectodomains ၏ တစ်ဆက်တည်း ချိန်ညှိမှု။ConSurf ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ရှေးရိုးဆန်သောရာထူးအများစုကို အပြာရောင်ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည်။Cysteine ​​အကြွင်းအကျန်များကို အနီရောင်ဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြသည်။ဒိုမိန်းနယ်နိမိတ်များနှင့် အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဒြပ်စင်များကို ချိန်ညှိမှု၏ထိပ်တွင်ပြသထားပြီး မြှားများသည် β-strands နှင့် waves များကို helices ညွှန်ပြသည့်နေရာတွင် ပြထားသည်။စည်းဆက်များပါရှိသော NCBI Access Identifiers များမှာ- လူသား (Homo sapiens၊ NP_001303901)၊ mandrill (Mandrilus leucophaeus၊ XP_011821277)၊ capuchin မျောက် (Cebus mimic၊ XP_017359366)၊ horse (Equus 120235)၊ _23 XP_032_034)။), သိုး (Ovis aries, XP_014955560), ဆင် (Loxodonta africana, XP_010585293), ခွေး (Canis lupus familyis, XP_025277208), မောက်စ် (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (Sarcophii, XP18, Tasmanian devil) (Sarcophii) ၎၊ ၈) , 61_89 နှင့် Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113)။နံပါတ်စဉ်သည် လူ့အစီအစဥ်ပေါ်တွင် အခြေခံသည်။b ထိပ်ရှိ 4HB နှင့် SPACA6 ဖွဲ့စည်းပုံ၏ မျက်နှာပြင်ကို ကိုယ်စားပြုပြီး အောက်ခြေရှိ Ig-like ဒိုမိန်း၊ ConSurf ဆာဗာမှ ထိန်းသိမ်းမှု ခန့်မှန်းချက်များကို အခြေခံထားသော အရောင်များ။အကောင်းဆုံး ထိန်းသိမ်းထားသော အစိတ်အပိုင်းများမှာ အပြာရောင်ဖြစ်ပြီး အတန်အသင့် ထိန်းသိမ်းထားသော အစိတ်အပိုင်းများမှာ အဖြူရောင်ဖြစ်ပြီး ထိန်းသိမ်းမှုအနည်းဆုံးမှာ အဝါရောင်ဖြစ်သည်။ခရမ်းရောင် cysteine ​​။မြင့်မားသောကာကွယ်မှုအဆင့်ကို သရုပ်ပြသည့် မျက်နှာပြင်ဖာထေးသုံးကွက်ကို ထည့်သွင်းထားသော အညွှန်းတပ်ထားသော ဖာထေးကွက် 1၊ 2 နှင့် 3 တွင် ပြသထားသည်။ 4HB ကာတွန်းကို ညာဘက်အပေါ်ရှိ inset (အရောင်တူ) တွင် ပြသထားသည်။
SPACA6 ဖွဲ့စည်းပုံတွင် အလွန်ထိန်းသိမ်းထားသော မျက်နှာပြင်ဒေသ သုံးခု (ပုံ။ 6b) ရှိသည်။Patch 1 သည် 4HB နှင့် ပတ္တာဧရိယာကို ချဲ့ထွင်ပြီး ထိန်းသိမ်းထားသော CXXC disulfide တံတားနှစ်စင်း၊ Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ပတ္တာကွန်ရက် (ပုံ။ S7) နှင့် ထိန်းသိမ်းထားသော အပြင်ဘက်မွှေးရနံ့ (Phe31၊ Tyr73၊ Phe137) တို့ပါရှိသည်။သုတ်ပိုးမျက်နှာပြင်ပေါ်ရှိ အပြုသဘောဆောင်သော အကြွင်းအကျန်များစွာကို ကိုယ်စားပြုသည့် Ig-like domain (ပုံ။ S6e) ၏ ပိုကျယ်သောအနားသတ်တစ်ခု။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ ဤ patch တွင် SPACA6 30 လုပ်ဆောင်ချက်ကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေရန် ယခင်ကပြသခဲ့သည့် ပဋိပစ္စည်း epitope ပါရှိသည်။တိုင်းဒေသကြီး 3 သည် ပတ္တာနှင့် Ig-ကဲ့သို့သော ဒိုမိန်း၏ တစ်ဖက်ခြမ်းကို ဖြန့်ခွဲထားသည်။ဤဒေသတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော ပရိုလိုင်းများ (Pro126၊ Pro127၊ Pro150၊ Pro154) နှင့် အပြင်ဘက်မျက်နှာမူသော ဝင်ရိုးစွန်း/အားသွင်းထားသည့် အကြွင်းအကျန်များ ပါရှိသည်။အံ့အားသင့်စရာမှာ၊ 4HB ၏မျက်နှာပြင်ပေါ်ရှိ အကြွင်းအကျန်အများစုသည် SPACA6 homologue ( hydrophobic bundle core ၏ရှေးရိုးစွဲယုံကြည်မှုဖြင့်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) နှင့် IST superfamily ထက်ကျော်လွန်နေသော်လည်း၊ ခေါက်သည် အလွန်ပြောင်းလဲနိုင်သည် (ပုံ. 6b)။
ဤအရာသည် SPACA6 တွင် အသေးငယ်ဆုံးဒေသဖြစ်ပြီး helical bundle နှင့် β-sandwich ၏ တိမ်းညွှတ်မှုသည် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှပါဝင်ကြောင်း ညွှန်ပြနိုင်သည့် ပတ္တာဒေသအကြွင်းအကျန်များစွာ (ဒေသ 3 အပါအဝင်) အများအပြားကို SPACA6 တွင် အလွန်ထိန်းသိမ်းထားသည်။ရှေးရိုးစွဲသမားအဖြစ်။သို့သော်၊ SPACA6 နှင့် IZUMO1 ၏ပတ္တာဒေသရှိ ကျယ်ပြန့်သော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးနှင့် electrostatic ကွန်ရက်များရှိနေသော်လည်း၊ IZUMO137,43,44 ၏ခွင့်ပြုထားသောဖွဲ့စည်းပုံအများအပြားကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေသော ပင်ကိုယ်ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်အထောက်အထားကို တွေ့မြင်နိုင်သည်။ဒိုမိန်းတစ်ခုချင်းစီ၏ ချိန်ညှိမှုသည် ကောင်းမွန်စွာ ထပ်နေသော်လည်း တစ်ခုနှင့်တစ်ခု ဆက်စပ်နေသော ဒိုမိန်းများ၏ တိမ်းညွှတ်မှုသည် ဗဟိုဝင်ရိုးမှ 50° မှ 70° အထိ ကွဲပြားသည် (ပုံ။ S16)။ဖြေရှင်းချက်တွင် SPACA6 ၏ ပုံသဏ္ဍာန်ဆိုင်ရာ ဒိုင်းနမစ်များကို နားလည်ရန် SAXS စမ်းသပ်မှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (ပုံ။ S17a၊ b)။Kratky ဇာတ်ကွက်သည် ပျော့ပြောင်းမှုအတိုင်းအတာအချို့ (ပုံ။ S17b) ကိုပြသထားသော်လည်း SPACA6 ectodomain ၏ Ab initio ပြန်လည်တည်ဆောက်မှုသည် လှံသလင်းကျောက်ပုံစံ (ပုံ. S18) နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ဤပုံစံသည် IZUMO1 နှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်ပြီး၊ ယင်းတွင် ဘောင်မပါသောပရိုတင်းသည် ကွက်လပ်အတွင်းနှင့် ဖြေရှင်းချက် 43 တွင် boomerang ပုံသဏ္ဍာန်အဖြစ် ယူဆသည်။
လိုက်လျောညီထွေရှိသောဒေသကို အတိအကျခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်၊ ဟိုက်ဒရိုဂျင်-ဒြူထရီယမ်ဖလှယ်မှုအစုလိုက်အပြုံလိုက် spectroscopy (H-DXMS) ကို SPACA6 တွင်ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ယခင်က IZUMO143 တွင်ရရှိသောဒေတာနှင့်နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည် (ပုံ။ 7a၊SPACA6 သည် 100,000 s လဲလှယ်ပြီးနောက် တည်ဆောက်ပုံတစ်လျှောက်တွင် ပိုမိုမြင့်မားသော deuterium လဲလှယ်ခြင်းဖြင့် သက်သေပြထားသည့်အတိုင်း IZUMO1 ထက် သိသိသာသာ ပိုပြောင်းလွယ်သည်။တည်ဆောက်ပုံနှစ်ခုလုံးတွင်၊ ပတ္တာဧရိယာ၏ C-terminal အပိုင်းသည် မြင့်မားသောဖလှယ်မှုကိုပြသသည်၊ ၎င်းသည် တစ်ခုနှင့်တစ်ခုဆက်စပ်နေသော 4HB နှင့် Ig-like ဒိုမိန်းများကို အကန့်အသတ်ဖြင့်လည်ပတ်နိုင်စေနိုင်သည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ SPACA6 ပတ္တာ၏ C-terminal အပိုင်းသည် 147CDLPLDCP154 အကြွင်းအကျန်များပါ၀င်ပြီး အလွန်ထိန်းသိမ်းထားသော ဒေသ 3 (ပုံ။ 6b) သည် interdomain ပျော့ပြောင်းမှုသည် SPACA6 ၏ ဆင့်ကဲထိန်းသိမ်းထားသော အင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြနိုင်ပေသည်။ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ CD အပူအရည်ပျော်ခြင်းဒေတာသည် SPACA6 (Tm = 51.2°C) သည် IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (ပုံ။ S1e နှင့် S19) ထက် တည်ငြိမ်မှုနည်းကြောင်း ပြသခဲ့သည်။
SPACA6 နှင့် b IZUMO1 ၏ H-DXMS ပုံများ။ညွှန်ပြသည့်အချိန်မှတ်များတွင် ရာခိုင်နှုန်း deuterium ဖလှယ်မှုကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ဟိုက်ဒရိုဂျင်-ဒြူထရီယမ်လဲလှယ်မှုအဆင့်များကို အပြာရောင် (10%) မှ အနီရောင် (90%) အထိ အရောင်အဆင့်အလိုက် ဖော်ပြသည်။အနက်ရောင်သေတ္တာများသည် မြင့်မားသော ဖလှယ်မှုနယ်ပယ်များကို ကိုယ်စားပြုသည်။ပုံဆောင်ခဲဖွဲ့စည်းပုံတွင် တွေ့ရှိရသော 4HB၊ ပတ္တာနှင့် Ig ကဲ့သို့သော ဒိုမိန်း၏ နယ်နိမိတ်များကို မူလတန်းစီအထက်တွင် ပြထားသည်။10 s၊ 1000 s နှင့် 100,000 s တွင် Deuterium ဖလှယ်မှုအဆင့်ကို SPACA6 နှင့် IZUMO1 ၏ ဖောက်ထွင်းမြင်ရသော မော်လီကျူးမျက်နှာပြင်များပေါ်တွင် တင်ထားသော ကန့်လန့်ဖြတ်ဇယားပေါ်တွင် ကွက်တိကွက်တိထားသည်။50% အောက် deuterium exchange အဆင့်ရှိသော အဆောက်အဦများ၏ အစိတ်အပိုင်းများသည် အဖြူရောင်ဖြစ်သည်။50% H-DXMS လဲလှယ်မှုအထက် ဧရိယာများကို gradient စကေးဖြင့် အရောင်ခြယ်ထားသည်။
CRISPR/Cas9 နှင့် mouse gene နောက်ကောက်ကျသော မျိုးရိုးဗီဇနည်းဗျူဟာများကို အသုံးပြုခြင်းသည် သုက်ပိုးနှင့် မျိုးဥချိတ်ဆက်ခြင်းနှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းအတွက် အရေးကြီးသောအချက်များစွာကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့သည်။IZUMO1-JUNO နှင့် CD9 ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံ၏ ကောင်းမွန်သောသွင်ပြင်လက္ခဏာရှိသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုမှလွဲ၍ gamete ပေါင်းစပ်မှုနှင့်ဆက်စပ်သော ပရိုတင်းအများစုသည် တည်ဆောက်ပုံနှင့်လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းရှိသော သရုပ်သဏ္ဍာန်ရှိနေဆဲဖြစ်သည်။SPACA6 ၏ ဇီဝရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ လက္ခဏာရပ်များသည် မျိုးအောင်နေစဉ်အတွင်း ပေါင်းစပ်မှု/ပေါင်းစပ် မော်လီကျူးပဟေဋ္ဌိ၏ အခြားအပိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည်။
SPACA6 နှင့် IST superfamily ၏ အခြားအဖွဲ့ဝင်များသည် နို့တိုက်သတ္တဝါများအပြင် ငှက်များ၊ တွားသွားသတ္တဝါများနှင့် ကုန်းနေရေနေသတ္တဝါများတွင် အလွန်ထိန်းသိမ်းထားပုံရသည်။တကယ်တော့၊ zebrafish 59 တွင် မျိုးအောင်ရန်အတွက် SPACA6 သည်ပင် လိုအပ်သည်ဟု ထင်မြင်ယူဆရပါသည်။ ဤဖြန့်ဖြူးမှုသည် အခြားလူသိများသော gamete ပေါင်းစပ်ဆက်စပ်နေသော ပရိုတင်းများဖြစ်သည့် DCST134၊ DCST234၊ FIMP31 နှင့် SOF132 တို့နှင့် ဆင်တူသည်၊ ဤအချက်များသည် HAP2 ချို့တဲ့နေကြောင်း (လည်း GCS1) ဟုခေါ်သော ပရိုတင်းများသည် ပရိုတိန်းများစွာ၏ ဓာတ်ပြုလှုပ်ရှားမှုအတွက် တာဝန်ရှိသည်။အပင်များ၊ နှင့် arthropods များ။Fertilized fusion ပရိုတိန်း 60၊ 61။ SPACA6 နှင့် IZUMO1 အကြား ခိုင်မာသောဖွဲ့စည်းပုံသဏ္ဍာန်တူသော်လည်း၊ ထိုပရိုတိန်းနှစ်ခုလုံးကို ကုဒ်သွင်းထားသော မျိုးဗီဇများ နောက်ကောက်ကျခြင်းကြောင့် gamete fusion တွင် ၎င်းတို့၏ လုပ်ဆောင်ချက်များကို ထပ်တူထပ်မျှမဟုတ်ကြောင်း ညွှန်ပြသော ကြွက်ထီးများတွင် မျိုးမပွားနိုင်စေပါ။.ပို၍ကျယ်ပြန့်သည်မှာ၊ ပေါင်းစည်းခြင်းအဆင့်အတွက် လူသိများသော သုက်ပိုးပရိုတင်းများ မည်သည့်အရာမျှ မလိုအပ်တော့ပါ။
SPACA6 (နှင့် IST superfamily ၏အခြားအဖွဲ့ဝင်များ) သည် အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်ထားသောလမ်းဆုံများတွင်ပါဝင်ခြင်း၊ ပေါင်းစပ်အချက်များဆီသို့ အရေးကြီးသောပရိုတင်းများကိုစုဆောင်းရန်အတွက် intragametic ကွန်ရက်များဖွဲ့စည်းခြင်း သို့မဟုတ် ခဲယဉ်းသော fusogens များအဖြစ်ပင်လုပ်ဆောင်ခြင်းရှိမရှိ မေးခွန်းထုတ်စရာဖြစ်နေဆဲဖြစ်သည်။HEK293T ဆဲလ်များတွင် ပူးတွဲကိုယ်ခံအားကျဆင်းစေသည့်လေ့လာမှုများက အရှည်အပြည့် IZUMO1 နှင့် SPACA632 အကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော ectodomains များသည် Noda et al တွင်တွေ့မြင်ရသော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများဖြစ်သည်ဟု အကြံပြုခြင်းဖြင့် vitro တွင် အကျိုးသက်ရောက်မှုမရှိပါ။တည်ဆောက်မှုတွင် နှစ်ခုလုံးကို ဖျက်လိုက်သည် (မျိုးအောင်ခြင်းအတွက် မလိုအပ်ဟုပြသထားသည့် IZUMO1 ၏ cytoplasmic အမြီးကို သတိပြုပါ)။တစ်နည်းအားဖြင့်၊ IZUMO1 နှင့်/သို့မဟုတ် SPACA6 သည် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ သီးခြားပုံစံများ သို့မဟုတ် အခြားပရိုတိန်းများပါရှိသော မော်လီကျူးရှုပ်ထွေးမှုများကဲ့သို့သော ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ သီးခြားပုံစံများ သို့မဟုတ် ကျွန်ုပ်တို့တွင် မျိုးပွားခြင်းမပြုသော သီးခြားဆက်စပ်ပတ်ဝန်းကျင်များ လိုအပ်နိုင်သည်။IZUMO1 ectodomain သည် perivitelline space အတွင်းရှိ မျိုးဥနှင့် သုတ်ကောင်များ ပေါင်းစပ်မှုကို ပြေလည်အောင် ဆောင်ရွက်ပေးသည်ဟု ယုံကြည်သော်လည်း SPACA6 ectodomain ၏ ရည်ရွယ်ချက်မှာ မရှင်းလင်းပါ။
SPACA6 ၏ဖွဲ့စည်းပုံသည် ပရိုတိန်း-ပရိုတိန်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုတွင် ပါဝင်နိုင်သည့် ထိန်းသိမ်းထားသော မျက်နှာပြင်များစွာကို ဖော်ပြသည်။CXXC motif (အထက်သတ်မှတ်ထားသော Patch 1) နှင့် အနီးရှိ ပတ္တာဧရိယာ၏ ထိန်းသိမ်းထားသော အစိတ်အပိုင်း (အထက်တွင် သတ်မှတ်ထားသော Patch 1) တွင် ဇီဝမော်လီကျူးများကြားတွင် hydrophobic နှင့် π-stacking အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများနှင့် မကြာခဏဆက်စပ်လေ့ရှိသည့် အပြင်ဘက်မျက်နှာရှိ မွှေးရနံ့အကြွင်းအကျန်များစွာရှိသည်။Ig-like domain (ဒေသ 2) ၏ ကျယ်ပြန့်သော အခြမ်းများသည် မြင့်မားသော ထိန်းသိမ်းထားသော Arg နှင့် သူ၏ အကြွင်းအကျန်များဖြင့် အပြုသဘောဆောင်သော အကွက်များ ဖြစ်ပေါ်လာပြီး gamete fusion 30 ကို ပိတ်ဆို့ရန်အတွက် ယခင်က ဤဒေသနှင့် ဆန့်ကျင်သည့် ပဋိပစ္စည်းများကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ပဋိပစ္စည်းသည် arginine အကြွင်းအကျန် ခြောက်ခုအနက် သုံးခုပါရှိသော linear epitope 212RIRPAQLTHRGTFS225 ကို အသိအမှတ်ပြုပြီး His220 ကို အလွန်ထိန်းသိမ်းထားသည်။ဤ သီးခြား အကြွင်းအကျန်များ ပိတ်ဆို့ခြင်းကြောင့် သို့မဟုတ် ဒေသတစ်ခုလုံး၏ ကမောက်ကမဖြစ်မှုမှာ မရှင်းလင်းပါ။β-sandwich ၏ C-terminus အနီးရှိ ဤကွာဟချက်တည်နေရာသည် အိမ်နီးချင်း သုက်ပိုးပရိုတင်းများနှင့် cis-အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ညွှန်ပြသည်၊ သို့သော် oocyte ပရိုတင်းများနှင့် မဟုတ်ပါ။ထို့အပြင်၊ ပတ္တာအတွင်းတွင် အလွန်လိုက်လျောညီထွေရှိသော ပရိုလိုင်းကြွယ်ဝသော အရှုပ်အထွေး (site 3) ကို ထိန်းသိမ်းထားခြင်းသည် ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု၏ နေရာဖြစ်နိုင်သည် သို့မဟုတ် ဒိုမိန်းနှစ်ခုကြားတွင် ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ် ထိန်းထားနိုင်မှုကို ညွှန်ပြပါသည်။SPACA6 ၏ အမည်မသိ အခန်းကဏ္ဍအတွက် လိင်သည် အရေးကြီးသည်။gametes ၏ပေါင်းစပ်မှု။
SPACA6 တွင် Ig-like β-sandwiches အပါအဝင် intercellular adhesion ပရိုတင်းများ၏ ဂုဏ်သတ္တိများရှိသည်။ကော်ပရိုတိန်းများစွာ (ဥပမာ၊ cadherins၊ integrins၊ adhesins၊ နှင့် IZUMO1) တွင် ဆဲလ်အမြှေးပါးမှ ပရိုတင်းများကို ပတ်ဝန်းကျင်ပစ်မှတ်များအထိ 63,64,65 အထိ တိုးချဲ့နိုင်သော β-sandwich domains တစ်ခု သို့မဟုတ် တစ်ခုထက်ပို၍ ပိုင်ဆိုင်ပါသည်။SPACA6 ၏ Ig-like domain တွင် adhesion နှင့် cohesion ၏ β-sandwiches များတွင် တွေ့ရလေ့ရှိသော motif ပါရှိသည်- စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ clamps66 ဟုခေါ်သော β-sandwiches များ၏ အဆုံးတွင် အပြိုင်ချည်နှစ်ဆရှိသည်။ဤပုံစံသည် intercellular အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုတွင်ပါ ၀ င်သောပရိုတင်းများအတွက်တန်ဖိုးရှိသော shear force ကိုခံနိုင်ရည်တိုးစေသည်ဟုယုံကြည်သည်။သို့သော်၊ ဤ adhesins နှင့်ဆင်တူသော်လည်း၊ SPACA6 သည်ကြက်ဥဖြူများနှင့်အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိကြောင်းသက်သေအထောက်အထားမရှိပါ။SPACA6 ectodomain သည် JUNO နှင့် ချိတ်ဆက်၍မရပါ၊ ဤတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း SPACA6-expressing HEK293T ဆဲလ်များသည် zona 32 ချို့တဲ့သော oocytes နှင့် ဓါတ်ပြုမှုမရှိပါ။SPACA6 သည် intergatic bonds များကိုတည်ဆောက်ပါက၊ ဤအပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် ဘာသာပြန်ပြီးနောက်ပိုင်းပြုပြင်မွမ်းမံမှုများလိုအပ်နိုင်သည် သို့မဟုတ် အခြားသောသုတ်ပိုးပရိုတိန်းများဖြင့် တည်ငြိမ်နေမည်ဖြစ်သည်။နောက်ဆုံး သီအိုရီကို ထောက်ခံသောအားဖြင့်၊ IZUMO1 ချို့တဲ့သော သုတ်ပိုးများသည် oocytes နှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး၊ IZUMO1 မှလွဲ၍ အခြားသော မော်လီကျူးများသည် gamete adhesion အဆင့် 27 တွင် ပါဝင်နေကြောင်း သရုပ်ပြသည်။
ဗိုင်းရပ်စ်၊ ဆဲလ်လူလာနှင့် ဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာ ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများစွာတွင် ၎င်းတို့၏လုပ်ဆောင်မှုကို fuogens အဖြစ် ကြိုတင်ခန့်မှန်းနိုင်သော ဂုဏ်သတ္တိများရှိသည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ Viral fusion glycoproteins (အတန်းအစား I၊ II နှင့် III) တွင် ဟိုက်ဒရိုဖိုဘစ် ပေါင်းဖက်စပ် peptide သို့မဟုတ် ပရိုတင်း၏အဆုံးတွင် ကွင်းဆက်တစ်ခု ရှိသည်။IZUMO143 ၏ ရေအားလျှပ်စစ်မြေပုံနှင့် IST superfamily ၏ တည်ဆောက်ပုံ (သတ်မှတ်ပြီး ခန့်မှန်းထားသည်) တွင် ထင်ရှားသော hydrophobic fusion peptide မရှိပါ။ထို့ကြောင့်၊ IST ရှိ ပရိုတိန်းများသည် fusogens များအဖြစ် လုပ်ဆောင်ပါက၊ ၎င်းတို့သည် အခြားလူသိများသော ဥပမာများနှင့် ကွဲပြားသည့်ပုံစံဖြင့် လုပ်ဆောင်သည်။
နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ gamete ပေါင်းစပ်မှုနှင့်ဆက်စပ်သော ပရိုတင်းများ၏ IST superfamily ၏အဖွဲ့ဝင်များ၏လုပ်ဆောင်ချက်များသည် အံ့သြဖွယ်ပဟေဠိတစ်ခုအဖြစ် ကျန်ရှိနေပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏သွင်ပြင်လက္ခဏာဖြစ်သော SPACA6 ပြန်လည်ပေါင်းစပ်မော်လီကျူးနှင့် ၎င်း၏ဖြေရှင်းထားသောဖွဲ့စည်းပုံသည် ဤမျှဝေထားသောဖွဲ့စည်းပုံများနှင့် gamete တွယ်တာမှုနှင့် ပေါင်းစပ်မှုတို့တွင် ၎င်းတို့၏အခန်းကဏ္ဍကို ထိုးထွင်းသိမြင်စေမည်ဖြစ်သည်။
ခန့်မှန်းထားသော လူသား SPACA6 ectodomain (NCBI ချိတ်ဆက်မှုနံပါတ် NP_001303901.1; အကြွင်း 27–246) နှင့် သက်ဆိုင်သော DNA sequence ကို Drosophila melanogaster S2 ဆဲလ်များတွင် ဖော်ပြရန်အတွက် codon-optimized လုပ်ပြီး မျိုးရိုးဗီဇအပိုင်းအစတစ်ခုအဖြစ် ပေါင်းစပ်ထားသော Kodon-codon-optimized နှင့် မျိုးရိုးဗီဇအပိုင်းအစအဖြစ် ပေါင်းစပ်ထားပါသည်။BiP လျှို့ဝှက်ချက်အချက်ပြမှုနှင့် သက်ဆိုင်သော 5′ နှင့် 3′ တို့သည် ဤဗီဇ၏ ligation-အမှီအခိုကင်းသောကိုယ်ပွားအတွက် အဆုံးသတ်သည် pMT ဖော်ပြချက် vector သို့ သတ္တုလိုသီယွန်အင်မြှင့်တင်ပေးသူအား ပရိုမိုက်စင် (pMT-puro) ဖြင့်ရွေးချယ်ရန်အတွက် ပြုပြင်ထားသော သတ္တုလိုသီအိုနီအင်မြှင့်တင်ပေးသူအပေါ် အခြေခံထားသည်။pMT-puro vector သည် thrombin ကွဲထွက်သည့် site ကို 10x-His C-terminal tag (ပုံ S2) ဖြင့် encode လုပ်သည်။
SPACA6 pMT-puro vector ကို D. melanogaster S2 (Gibco) ဆဲလ်များထဲသို့ တည်ငြိမ်စွာ ကူးပြောင်းခြင်းကို IZUMO1 နှင့် JUNO43 အတွက် အသုံးပြုသည့် ပရိုတိုကောနှင့် အလားတူစွာ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။S2 ဆဲလ်များကို သန့်စင်ပြီး Schneider ၏ ကြားခံ (Gibco) တွင် နောက်ဆုံးပါဝင်မှု 10% (v/v) အပူ-မလှုပ်ရှားနိုင်သော သန္ဓေသားသွေးရည်ကြည် (Gibco) နှင့် 1X antimycotic ပဋိဇီဝဆေး (Gibco) တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။အစောပိုင်းလမ်းကြောင်းဆဲလ်များ (3.0 x 106 ဆဲလ်) ကို ရေတွင်း 6 တွင်း (Corning) ၏ တစ်တွင်းစီတွင် ချထားသည်။27°C တွင် ပေါက်ဖွားပြီး 24 နာရီကြာပြီးနောက်၊ ထုတ်လုပ်သူ၏ protocol အရ SPACA6 pMT-puro vector နှင့် Effectene transfection reagent (Qiagen) ၏ 2 mg ရောစပ်ထားသော ဆဲလ်များ ကူးစက်သွားပါသည်။ကူးစက်ထားသောဆဲလ်များကို 72 နာရီကြာပေါက်ဖွားပြီးနောက် 6 mg/ml puromycin ဖြင့် ရိတ်သိမ်းသည်။ထို့နောက် ဆဲလ်များကို Schneider ၏ အလတ်စားမှ ခွဲထုတ်ပြီး ကြီးမားသော ပရိုတင်းထုတ်လုပ်မှုအတွက် သွေးရည်ကြည်မှ Insect-XPRESS ကြားခံ (Lonza) တွင် ထားရှိခဲ့သည်။S2 ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှု 1 လီတာအသုတ်ကို 8-10 × 106 ml-1 ဆဲလ်များကို 2 L လေဝင်လေထွက်ရှိသော အောက်ခြေ polypropylene Erlenmeyer ဓာတ်ဘူးတွင် 8-10 × 106 ml-1 ဆဲလ်များအထိ ကြီးထွားစေပြီး နောက်ဆုံးပြင်းအား 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) ဖြင့် ပိုးသတ်ပြီး ပိုးမွှားကင်းစင်သည်။လှုံ့ဆော်ပေးသည်။မွေးဖွားလာသော ယဉ်ကျေးမှုများကို 27°C. rpm 120 တွင် လေးရက်ကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။
SPACA6 ပါ၀င်သော အအေးဒဏ်ခံအလတ်စားအား 4°C တွင် 5660×g တွင် centrifugation ဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီး 10 kDa MWCO အမြှေးပါးဖြင့် Centramate tangential flow filtration system (Pall Corp) ဖြင့် ခွဲထားသည်။SPACA6 ပါရှိသော စုစည်းလတ်ကို 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) ကော်လံသို့ လိမ်းပါ။Ni-NTA resin ကို ကြားခံ A ၏ ကော်လံ 10 ခု (CV) ဖြင့် ဆေးကြောပြီး နောက်ဆုံး imidazole ပြင်းအား 50 mM ပေးရန်အတွက် 1 CV ကို buffer A ကို ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်။SPACA6 အား နောက်ဆုံးပြင်းအား 500 mM အထိ imidazole နှင့် ဖြည့်စွက်ထားသော ကြားခံ A 10 ml ကို ဖယ်ထုတ်ထားသည်။Restriction class thrombin (Millipore Sigma) ကို dialysis tubing (MWCO 12-14 kDa) တွင် 1 ယူနစ်လျှင် 1 ယူနစ်တွင် SPACA6 နှင့် 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 နှင့် 150 mM NaCl (ကြားခံ B) ဖြင့် ကျောက်ကပ်ဆေးခြင်းအတွက်။) 4°C တွင် 48 နာရီ။ထို့နောက် thrombin-cleaved SPACA6 ကို ဆားပါဝင်မှုလျှော့ချရန် သုံးဆကို ရောနှောပြီး 1 ml MonoS 5/50 GL cation လဲလှယ်ကော်လံ (Cytiva/GE) တွင် 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 နှင့် ညီမျှသော 1 ml MonoS ပေါ်တွင် တင်ထားသည်။cation exchanger ကို 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ၏ 3 CV ဖြင့် ဆေးကြောလိုက်ပြီး၊ ထို့နောက် SPACA6 ကို linear gradient 0 မှ 500 mM NaCl ဖြင့် 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ဖြင့် 25 CV တွင် ထုတ်ယူသည်။ion exchange chromatography ပြီးနောက်၊ SPACA6 ကို 1 ml သို့ စုစည်းပြီး SPACA6 ပါရှိသော ENrich SEC650 10 x 300 ကော်လံ (BioRad) မှ ခွဲထုတ်လိုက်ပါသည်။16% SDS-polyacrylamide gel တွင် Coomassie-stained electrophoresis မှ သန့်စင်မှုကို ထိန်းချုပ်ထားသည်။Beer-Lambert ဥပဒေနှင့် သီအိုရီအရ အံသွားပေါက်ခြင်းဆိုင်ရာ ကိန်းဂဏန်းကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းအာရုံစူးစိုက်မှုကို 280 nm တွင် စုပ်ယူမှုဖြင့် တိုင်းတာသည်။
သန့်စင်ထားသော SPACA6 အား 10 mM ဆိုဒီယမ် ဖော့စဖိတ်၊ pH 7.4 နှင့် 150 mM NaF နှင့် စီဒီ spectroscopy ဖြင့် မခွဲခြမ်းမီ 0.16 mg/mL သို့ ဖျော်စပ်ထားသည်။လှိုင်းအလျား 185 မှ 260 nm ရှိသော CD များ၏ Spectral scanning ကို Jasco J-1500 spectropolarimeter တွင် 1 mm optical path length (Helma) မှ 50 nm/min နှုန်းဖြင့် 50 nm/min ဖြင့် quartz cuvettes ကို အသုံးပြု၍ Jasco J-1500 spectropolarimeter တွင် စုဆောင်းခဲ့ပါသည်။CD ရောင်စဉ်ကို အခြေခံမျဉ်းကြောင်းအတိုင်း ပြုပြင်ပြီး ပျမ်းမျှဝယ်ယူမှု 10 ကြိမ်ထက်မနည်းကို ဒီဂရီစင်တီမီတာ 2/dmol ဖြင့် အဓိပ္ပါယ်ကျန်နေသော ellipticity (θMRE) အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။
MW သည် Da ရှိ နမူနာတစ်ခုစီ၏ မော်လီကျူးအလေးချိန်၊N သည် အမိုင်နိုအက်ဆစ်အရေအတွက်၊θ သည် millidegrees တွင် ellipticity ဖြစ်သည်။d သည် စင်တီမီတာတွင် အလင်းလမ်းကြောင်း၏ အရှည်နှင့် ကိုက်ညီသည်။ပရိုတိန်းအာရုံစူးစိုက်မှုယူနစ်အတွက်။